标签归档：purexpress

PURExpress® 二硫键增强剂 |NEB酶试剂 New England Biolabs

发表于由

上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

PURExpress® 二硫键增强剂（PDBE）是一种专有的蛋白质和缓冲液混合物，当 PURExpress 体系合成的目的蛋白具有较多二硫键时，该产品的专属蛋白质和缓冲液成分能帮助其正确折叠。在合成反应开始时加入 PURExpress二硫键增强剂，能够协助半胱氨酸硫醇的氧化，并纠正硫醇的错误氧化。从而提高可溶性蛋白及具有功能活性蛋白的产量。

图 1： PURExpress® 二硫键增强剂 |
PURExpress 二硫键增强剂（PDBE）可促进活性 vtPA 的正确折叠，其是组织纤溶酶原激活物的截短版本，有 9 个二硫化物键，其中 8 个是非连续的。

（A.）反应按照 PURExpress 体系说明建立，以vtPA DNA 为模板。37℃温育 2 小时后，取 5 μl 反应液进行活性检测，在 1 小时内监测发光底物的剪切反应。（B.）各取 2.5 µl 反应液，用 SDS-PAGE 电泳分离，使用考马斯亮蓝染色。vtPA 目的蛋白用红色箭头标记。

添加 PDBE 产生活性蛋白。通过对靶标的功能活性检测，发现活性差异是由二硫键的折叠所致，而不是由于 PURExpress 体系合成蛋白产量导致的差异。

图 2： PURExpress® 二硫键增强剂 |
PURExpress 二硫键增强剂经过优化，适合用于 PURExpress 体系，但也适用于其它供应商的基于 S30 裂解的 IVTT 试剂盒。根据厂商说明书来建立反应体系：用等量的模板 DNA 编码组织纤溶酶原活化剂的截短版本（9 个二硫键，其中 8 个为非连续）。温育两小时后，各取 5 µl 进行活性测定，并监测切割 1 小时的显色底物。
图 3： PURExpress® 二硫键增强剂 |
PURExpress 二硫键增强剂促进活性 Gaussia 荧光素酶（GLuc）的正确折叠，该酶含有 5 个可能二硫键。用等量的模板 DNA 编码 GLuc，按照 PURExpress 体系说明书建立反应体系。37℃温育 2 小时后，每个反应取一式三份（2.5 µl/份），与 50 µl GLuc 底物溶液温育，在 4 秒计数时段后记录相对发光强度。
产品类别:
NEBExpress® Cell-free E. coli Protein Synthesis System,
PURExpress,
Cell-Free Protein Expression Products,

Protein Expression Products

应用:
NEBExpress® Cell-free E. coli Protein Synthesis System,
PURExpress,
Cell-Free Protein Expression,

Expression of Difficult Proteins,
Disulfide-bonded Protein Expression,

Protein Expression

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E6820S     -20    
        PURExpress Disulfide Bond Enhancer 1 P6821AVIAL -20 1 x 0.05 ml 25 X
        Enhancer 2 B6822AVIAL -20 1 x 0.05 ml 25 X

  • 相关产品

    相关产品

    • PURExpress® 体外蛋白合成试剂盒
    • PURExpress® Δ Ribosome 试剂盒
    • PURExpress® Δ (aa, tRNA) 试剂盒
    • PURExpress® Δ RF123 试剂盒

  • 注意事项

    1. PURExpress 二硫键增强剂经过优化，能够与 NEB PURExpress 体系（NEB #E6800、E3313）一起使用。然而，它与其它供应商的细菌 S30 裂解物 IVTT 体系兼容（图 2）。由于其它体系的产品剂型不同，因此与 PDBE 相关的所有指南、操作说明和常见问题解答均仅适用于 PURExpress 体系。

  • 参考文献

    1. Harada R, Furumoto S, Yoshikawa T, Ishikawa Y, Shibuya K, Okamura N, Ishiwata K, Iwata R, Yanai K (2016). Synthesis and Characterization of 18F-Interleukin-8 Using a Cell-Free Translation System and 4-18F-Fluoro-L-Proline.. Journal of Nuclear Medicine. 57 (4), 634-639. DOI: 10.2967/jnumed.115.162602 PubMedID: 26742712
    2. Horiya S, Bailey JK, Krauss IJ (2017). Directed Evolution of Gycopeptides Using mRNA Display.. Methods in Enzymology . DOI: 10.1016/bs.mie.2017.06.029 PubMedID: 28935113
    3. Huang A, P.Q. Nguyen, J.C. Stark, M.K. Takahashi, N. Donghia, T. Ferrante, A.J. Dy, K.J. Hsu, R.S. Dubner, K. Pardee, M.C. Jewett and J.J. Collins (2018). Biobits™ Explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8),
    4. Mankowska, S.A., P. Gatti-Lafranconi, M. Chodorge, S. Sridharan, R.R. Minter and F. Hollfelder (2016). A Shorter Route to Antibody Binders via Quantitative in vitro Bead-Display Screening and Consensus Analysis. Scientific Reports. 6,
    5. Pardee K, Slomovic S, Nguyen PQ, Lee JW, Donghia N, Burrill D, Ferrante T, McSorley FR, Furuta Y, Vernet A, Lewandowski M, Boddy CN, Joshi NS, Collins JJ (2016). Portable, On-Demand Biomolecular Manufacturing. Cell. 248-259 e212. DOI: 10.1016/j.cell.2016.09.013 PubMedID: 27662092
    6. Price A.K., MacConnell A.B., Paegel B.M. (2014). Microfluidic bead suspension hopper. Analytical Chemistry. 86 (10), 5039-5044. DOI: 10.1021/ac500693r PubMedID: 24761972
    7. Price A.K., MacConnell A.B., Paege B.M. (2016). hnuSABR: Photochemical Dose-Response Bead Screening in Droplets.. Analytical Chemistry. 88 (5), 2904-2911.
    8. Ren G, Ke N, Berkmen M (2016). Use of the SHuffle Strains in Production of Proteins. Current Protocols in Protein Science. 85, DOI: 10.1002/cpps.11 PubMedID: 27479507
    9. Tran D.T., Cavett V.J., Dang V.Q., Torres H.L., Paegel B.M. (2016). Evolution of a mass spectrometry-grade protease with PTM-directed specificity. Proceedings of the National Acadmey of Sciences of the United States of America. 113 (51), 14686-14691. DOI: 10.1073/pnas.1609925113 PubMedID: 27940920

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. PURExpress Disulfide Bond Enhancer (E6820)

  • 应用实例

    • AppNote_Use_of_PURExpress _and_PDBE_to_Express_Active_Proteins_that_can_be_Expressed_in vivo_in_Shuffle_Competent_Cells
    • NEBExpress® Cell-free E. coli Protein Synthesis System

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Is the PURExpress® In Vitro Protein Synthesis Kit capable of dealing with disulfide bonds? If not, can you recommend something else to use post synthesis?

  • 实验技巧

    可能需要对溶液 1 和溶液 2 进行滴定测试，以获得最佳的蛋白折叠。每种溶液从 1 ul 的量开始。
    可与 S30 裂解物和 PURExpress 一起使用。

PURExpress® 体外蛋白合成试剂盒 |NEB酶试剂 New England Biolabs

发表于由

上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

PURExpress® 体外蛋白合成试剂盒是新型无细胞转录/翻译体系，用于基因快速表达分析，是由大肠杆菌翻译所必需组份纯化而构成。PURExpress 体系无核酸酶和蛋白酶的污染，保护了 DNA 和 RNA模板/复合体，避免了蛋白的修饰及降解。转录和翻译过程仅需将两管试剂混合，一步反应即可完成，几个小时内即可获得实验结果，PURExpress 体系大大地节省了宝贵的实验时间，是用于高通量技术的理想选择。

PURExpress 文献引用

图 1：使用 PURExpress® 体外蛋白合成试剂盒的表达蛋白 PURExpress® 体外蛋白合成试剂盒 |
在 25 μl 反应体系中加入 250 ng 模板 DNA 和 20 单位 RNase 抑制剂，37℃ 温育 2 小时。各取 2.5 μl 反应液使用 10 – 20% Tris-甘氨酸凝胶进行 SDS-PAGE 电泳分析。红点处指示为目的蛋白。Marker M 是蛋白质分子量标准（NEB #P7703 已停产，被 NEB #P7717 替代）。
图 2：添加 35S-甲硫氨酸通过放射自显影显示蛋白 PURExpress® 体外蛋白合成试剂盒 |
在 25 μl 反应中加入 250 ng 模板 DNA、20 单位 RNase 抑制剂以及 2 μl 35S-甲硫氨酸，37℃ 温育 2 小时。各取 2.5 μl 反应液进行 SDS-PAGE 电泳分析，将凝胶固定 10 分钟，80℃干燥 2 小时，并在 -80℃ 条件下使用 x 射线胶片曝光 5 小时。
图 3：使用 PURExpress 体系进行蛋白质合成和纯化示意图PURExpress® 体外蛋白合成试剂盒 |
图 4：使用 PURExpress 体系表达和反向纯化 DHFR（A）和 T4 DNA 连接酶（B） PURExpress® 体外蛋白合成试剂盒 |
根据随附产品说明书中的建议，使用 125 μl 的反应体系。样本使用经考马斯亮蓝染色的 10 – 20% Tris-甘氨酸凝胶进行分析。在这两种情况下，目的蛋白都可以在总蛋白质的条带中可见。红点处指示为目的蛋白。Marker M 是蛋白质分子量标准（NEB# P7703 已停产，被 NEB #P7717 替代）。
产品类别:
PURExpress,
Cell-Free Protein Expression Products,
Protein Expression Products

应用:
PURExpress,
Toxic Protein Expression,
Cell-Free Protein Expression,

High-throughput cloning and automation solutions,
Expression of Difficult Proteins,
Disulfide-bonded Protein Expression,

Protein Expression

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E6800S     -80    
        PURExpress Solution A B0228AVIAL -80 1 x 0.1 ml 2.5 X
        Solution B (75 μl) P0760AVIAL -80 1 x 0.075 ml Not Applicable
        PURExpress Control DHFR Plasmid N0424AVIAL -20 1 x 0.01 ml 125 ng/µl
    • E6800L     -80    
        PURExpress Solution A B0228AVIAL -80 10 x 0.1 ml 2.5 X
        Solution B (75 μl) P0760AVIAL -80 10 x 0.075 ml Not Applicable
        PURExpress Control DHFR Plasmid N0424AVIAL -20 1 x 0.01 ml 125 ng/µl

  • 优势和特性

    应用特性

    • 快速合成用于蛋白质特性研究的分析量级别的样本
    • 确认开放阅读框
    • 检测突变对 ORF 的影响
    • 合成具有活性和功能域的截短蛋白
    • 掺入修饰的、非天然的或标记的氨基酸
    • 绘制抗原表位图谱
    • 毒性蛋白表达
    • 核糖体展示
    • 翻译和/或蛋白折叠研究
    • 体外区域化

  • 相关产品

    相关产品

    • PURExpress® Δ (aa, tRNA) 试剂盒
    • PURExpress® Δ RF123 试剂盒
    • 小鼠 RNase 抑制剂
    • PURExpress® Δ Ribosome 试剂盒
    • E. coli 核糖体
    • PURExpress® 二硫键增强剂

  • 注意事项

    1. 提供 125 ng/µl 的对照（DHFR）模板。使用 2 µl 模板进行阳性对照反应。模板 DNA，特别是通过质粒小提制备的 DNA（如 Qiagen）通常是 RNase 酶污染的主要来源。我们强烈建议在每个反应中加入 20 单位的小鼠 RNase 抑制剂（NEB #M0314）。
    2. PURExpress DHFR 对照模板序列文件：Fasta GenBank
    3. 贮存条件：试剂盒所有组份必须贮存于 -80℃。
    4. 将溶液 B 加入溶液 A 中，不要在未缓冲的情况下稀释溶液 B。我们建议 25 μl 反应体系中模板 DNA 的起始量为 250 ng。可以通过建立多个反应并滴定加入不同起始量的 DNA，来确定模板 DNA 的最佳用量。通常情况下，每 25 μl 反应体系中，模板 DNA 最佳用量范围在 25 – 1000 ng 之间。

  • 参考文献

    1. Asahara, H. and Chong, S. (2010). In vitro genetic reconstruction of bacterial transcription initiation by coupled synthesis and detection of RNA polymerase holoenzyme. Nuc.Acid. Res.
    2. Desai, Bijoy J., Yuki Goto, Alessandro Cembran, Alexander A. Fedorov, Steven C. Almo, Jiali Gao, Hiroaki Suga, and John A. Gerlt (2014). Investigating the role of a backbone to substrate hydrogen bond in OMP decarboxylase using a site-specific amide to ester substitution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 201411772.
    3. Gu, Liangcai, Chao Li, John Aach, David E. Hill, Marc Vidal, and George M. Church (2014). Multiplex single-molecule interaction profiling of DNA-barcoded proteins. Nature.
    4. Gupta, Pulkit, Shanmugapriya Sothiselvam, Nora Vázquez-Laslop, and Alexander S. Mankin (2013). Deregulation of translation due to post-transcriptional modification of rRNA explains why erm genes are inducible. Nature communications. 4,
    5. Kaiser, Christian M., Daniel H. Goldman, John D. Chodera, Ignacio Tinoco, and Carlos Bustamante (2011). The ribosome modulates nascent protein folding. Science. 334 (6063), 1723-1727.
    6. Nakagawa, So, Stephen S. Gisselbrecht, Julia M. Rogers, Daniel L. Hartl, and Martha L. Bulyk (2013). DNA-binding specificity changes in the evolution of forkhead transcription factors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110(30), 12349-12354.
    7. Ramadoss, Nitya S., John N. Alumasa, Lin Cheng, Yu Wang, Sharon Li, Benjamin S. Chambers, Hoon Chang et al (2013). Small molecule inhibitors of trans-translation have broad-spectrum antibiotic activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110(25), 10282-10287.
    8. Rosenblum, Gabriel, and Barry S. Cooperman (2014). Engine out of the chassis: Cell-free protein synthesis and its uses. FEBS letters. 588(2), 261-268.
    9. Stafford, Ryan L., Marissa L. Matsumoto, Gang Yin, Qi Cai, Juan Jose Fung, Heather Stephenson, Avinash Gill et al (2014). In vitro Fab display: a cell-free system for IgG discovery. Protein Engineering Design and Selection. 27(4), 97-109.
    10. Tuckey, Corinna, Haruichi Asahara, Ying Zhou, and Shaorong Chong (2014). Protein Synthesis Using a Reconstituted Cell‐Free System. Current Protocols in Molecular Biology. 16-31.
    11. Weirauch, Matthew T., Atina Cote, Raquel Norel, Matti Annala, Yue Zhao, Todd R. Riley, Julio Saez-Rodriguez et al (2013). Evaluation of methods for modeling transcription factor sequence specificity. Nature biotechnology. 31(2), 126-134.
    12. Noto, T., Kurth, H., Kataoka, K., Aronica, L., DeSouza, L., Siu, K., Pearlman, R., Gorovsky, M. and Mochizuki, K. (2010). The tetrahymena argonaute-binding protein Giw1p directs a mature argonaute-siRNAcomplex to the nucleus. Cell. 140, 692-703.
    13. Tanner, D., Cariello, D., Woolstenhulme, C., Broadbent, M. and Buskirk, A. (2009). Genetic identification of nascent peptides that induce ribosome stalling. J. Biol.Chem. 284, 34809-34818.
    14. Talabot-Ayer, D., Lamacchia, C., Gabay, C., and Palmer, G. (2009). Interleukin-33 is biologically activeindependently of Caspase-1 cleavage. J. Biol.Chem. 284, 19420-19426.
    15. Feng, Y. and Cronan, J. E. (2009). A new memberof the Eschericia coli fad regulon: transcriptional regulation offadM (ybaW). J.Bacteriol. 191, 6320-6328.
    16. Solaroli, N., Panayiotou, C., Johansson, M., and Karlsson, A. (2009). Identification of two active functional domains of human adenylate kinase 5. FEBSLett. 283, 2872-2876.
    17. Arenz, Stefan, Haripriya Ramu, Pulkit Gupta, Otto Berninghausen, Roland Beckmann, Nora Vázquez-Laslop, Alexander S. Mankin, and Daniel N. Wilson (2014). Molecular basis for erythromycin-dependent ribosome stalling during translation of the ErmBL leader peptide. Nature communications. 5,
    18. Chong, Shaorong (2014). Overview of Cell‐Free Protein Synthesis: Historic Landmarks, Commercial Systems, and Expanding Applications. Current Protocols in Molecular Biology. 16-30.
    19. Daugherty, Ashley B., Sridhar Govindarajan, and Stefan Lutz (2013). Improved Biocatalysts from a Synthetic Circular Permutation Library of the Flavin-Dependent Oxidoreductase Old Yellow Enzyme. Journal of the American Chemical Society . 334 (38), 14425-14432.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Protein Synthesis Reaction using PURExpress (E6800)
    2. Analysis of Synthesized Protein using PURExpress (E6800)
    3. Determination of Protein Synthesis Yield with PURExpress (E3313, E6800, E6840, E6850)
    4. Purification of Synthesized Protein using Reverse His-tag Purification
    5. Measurement of 35S-Methionine Incorporation by TCA Precipitation and Yield Determination using PURExpress

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE6800_E3313_E6840_E6850

  • 应用实例

    • Use of the PURExpress® in vitro Protein Synthesis Kit, Disulfide Bond Enhancer and SHuffle® Competent E. coli for heterologous in vitro and in vivo cellulase expression.
    • Scaling down to scale up Miniaturizing cell free protein synthesis reactions with the Echo 525 Acoustic Liquid Handler

工具 & 资源

  • 选择指南

    • Protein Expression and Purification Selection Chart
    • PURExpress® vs. NEBExpress® Application Chart

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. When using PURExpress, I was unable to synthesize the control protein?
    2. When using PURExpress, I was able to synthesize the control protein, but the target sample is not present or present in low yield?
    3. When using PURExpress, I was able to synthesize the target protein, but full-length product is not major species?
    4. Where can I find many more detailed FAQs for PURExpress?
    5. Are there PURExpress citations?

  • 实验技巧

    在冰上融化试剂和建立反应体系
    使用前，请将溶液 A 和 B 充分混合。不要涡旋溶液 B 或核糖体，将其轻轻混合。
    溶液 A 可能呈浑浊白色。以均匀悬浮状态加入到反应中。
    在冰上按下列加样顺序建立反应体系：溶液 A、溶液 B、RNAse 抑制剂、水、模板 DNA 或 RNA
    建立反应体系后，要确保所有试剂都充分混合，可以轻柔地上下吸打混匀并进行短暂瞬时离心，37℃条件下温育 2 到 4 小时。

PURExpress® Δ (aa, tRNA) 试剂盒 |NEB酶试剂 New England Biolabs

发表于由

上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

PURExpress® 体外蛋白合成试剂盒是新型无细胞转录/翻译体系，用于基因快速表达分析，是由大肠杆菌翻译所必需组份纯化而构成。PURExpress 体系无核酸酶和蛋白酶的污染，保护了 DNA 和 RNA模板/复合体，避免了蛋白的修饰及降解。转录和翻译过程仅需将两管试剂混合，一步反应即可完成，几个小时内即可获得实验结果，PURExpress 体系大大地节省了宝贵的实验时间，是用于高通量技术的理想选择。

PURExpress 文献引用

图 1：使用 PURExpress® 体外蛋白合成试剂盒的表达蛋白。 PURExpress® Δ (aa, tRNA) 试剂盒 |
在 25 μl 反应体系中加入 250 ng 模板 DNA 和 20 单位 RNase 抑制剂，37℃ 温育 2 小时。各取 2.5 μl 反应液使用 10 – 20% Tris-甘氨酸凝胶进行 SDS-PAGE 电泳分析。红点处指示为目的蛋白。Marker M 是蛋白质分子量标准（NEB #P7703 已停产，被 NEB #P7717 替代）。

图 2： 添加 35S-甲硫氨酸通过放射自显影显示蛋白。
PURExpress® Δ (aa, tRNA) 试剂盒 |
在 25 μl 反应中加入 250 ng 模板 DNA、20 单位 RNase 抑制剂和 2 μl 35S-甲硫氨酸， 37℃ 温育 2 小时。各取 2.5 μl 反应液进行 SDS-PAGE 电泳分析，将凝胶固定 10 分钟， 80℃ 干燥 2 小时，并在 -80℃ 条件下使用 x 射线胶片曝光 5 小时。

图 3：使用 PURExpress 体系进行蛋白合成和纯化示意图。 PURExpress® Δ (aa, tRNA) 试剂盒 |
图 4：使用 PURExpress 体系表达和反向纯化 DHFR（A）和 T4 DNA 连接酶（B）。 PURExpress® Δ (aa, tRNA) 试剂盒 |
根据随附产品说明书中的建议，使用 125 μl 的反应体系。样本使用经考马斯亮蓝染色的 10 – 20% Tris-甘氨酸凝胶进行分析。在这两种情况下，目的蛋白都可以在总蛋白质的条带中可见。红点处指示为目的蛋白。Marker M 是蛋白质分子量标准（NEB #P7703 已停产，被 NEB #P7717 替代）。

产品类别:
PURExpress,
Cell-Free Protein Expression Products,
Protein Expression Products

应用:
PURExpress,
Cell-Free Protein Expression,
Protein Expression

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E6840S     -80    
        PURExpress Solution A (-aa, tRNA) B6841AVIAL -80 1 x 0.05 ml 5 X
        E. coli tRNA (25 μl) N6842AVIAL -80 1 x 0.025 ml Not Applicable
        Amino Acid Mix (25 μl) N6843AVIAL -80 1 x 0.025 ml Not Applicable
        Solution B P6840AVIAL -80 1 x 0.075 ml Not Applicable
        PURExpress Control DHFR Plasmid N0424AVIAL -20 1 x 0.01 ml 125 ng/µl

  • 特性和用法

    需要但不提供的材料

    • 一般条件：37℃温育
    • 标记：35S-甲硫氨酸（建议 > 1000 Ci/mmol，体外翻译级）
    • TCA 沉淀：TCA 溶液（25%、10%）、1 M NaOH、酪胺酸、乙醇、玻璃纤维过滤器、真空过滤歧管
    • SDS-PAGE：凝胶和电泳缓冲液、凝胶装置、电源、凝胶干燥器
    • 蛋白免疫印迹法：转移装置、膜、抗体和检测试剂
    • 纯化：Ni-NTA 琼脂糖、Amicon Ultra- 0.5 ml、Ultracel- 100K 膜离心过滤器

  • 优势和特性

    应用特性

    • 快速合成用于蛋白质特性研究的分析量级别的样本
    • 确认开放阅读框
    • 检测突变对 ORF 的影响
    • 合成具有活性和功能域的截短蛋白
    • 掺入修饰的、非天然的或标记的氨基酸
    • 绘制抗原表位图谱
    • 毒性蛋白表达
    • 核糖体展示
    • 翻译和/或蛋白折叠研究
    • 体外区域化

  • 相关产品

    相关产品

    • PURExpress® Δ RF123 试剂盒
    • PURExpress® 体外蛋白合成试剂盒
    • PURExpress® 二硫键增强剂
    • 小鼠 RNase 抑制剂
    • PURExpress® Δ Ribosome 试剂盒
    • E. coli 核糖体

  • 注意事项

    1. 阳性对照反应中，加入 2 μl 的对照（DHFR）模板以及氨基酸混合液和 tRNA 各 2.5 μl。
    2. 每个试剂盒提供的试剂足够进行 10 次反应（25 µl 反应体系/次）。
      该试剂盒单独提供氨基酸和 tRNA，用户可通过在反应中加入经修饰的氨基酸和 tRNA 混合液进行蛋白质合成反应。
    3. 将溶液 B 加入溶液 A 中，不要在未缓冲的情况下稀释溶液 B。我们建议 25  μl 反应体系中模板 DNA 的起始量为 250 ng 。可以通过建立多个反应并滴定加入不同起始量的 DNA，来确定模板 DNA 的最佳用量。通常情况下，每 25 μl 反应体系中，模板 DNA 的最佳用量范围在 25 – 1000 ng 之间。
    4. PURExpress DHFR 对照模板序列文件：Fasta、GenBank
    5. 提供 125 ng/μl 的对照（DHFR）模板。使用 2 μl 进行阳性对照反应。模板 DNA，特别是通过质粒小提制备的 DNA（如 Qiagen）通常是 RNase 酶污染的主要来源。我们强烈建议在每个反应中加入 20 单位的小鼠 RNase 抑制剂（NEB #M0314）。

  • 参考文献

    1. Martínez, A. K., E. Gordon, et al. (2013). Interactions of the TnaC nascent peptide with rRNA in the exit tunnel enable the ribosome to respond to free tryptophan. Nucleic Acids Research. 42(2), 1245-56. PubMedID: 24137004
    2. Horiya S, Bailey J.K., Krauss I.J. (2017). Directed Evolution of Glycopeptides Using mRNA Display.. Methods in Enzymology. DOI: 10.1016/bs.mie.2017.06.029 PubMedID: 28935113
    3. Houwman J.A., André E, Westphal A.H., van Berkel W.J., van Mierlo C.P. (2016). The Ribosome Restrains Molten Globule Formation in Stalled Nascent Flavodoxin.. The Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 25911-25920. DOI: 10.1074/jbc.M116.756205 PubMedID: 27784783
    4. Huang W.P., Cho C.P., Chang K.Y. (2018). mRNA-Mediated Duplexes Play Dual Roles in the Regulation of Bidirectional Ribosomal Frameshifting.. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 3867. DOI: 10.3390/ijms19123867 PubMedID: 30518074
    5. Martínez A.K., Gordon E, Sengupta A, Shirole N, Klepacki D, Martinez-Garriga B, Brown L.M., Benedik M.J., Yanofsky C, Mankin A.S., Vazquez-Laslop N, Sachs M.S., Cruz-Vera L.R. (2014). Interactions of the TnaC nascent peptide with rRNA in the exit tunnel enable the ribosome to respond to free tryptophan.. Nucleic Acids Research. 42 (2), 1245-1256. DOI: 10.1093/nar/gkt923 PubMedID: 24137004
    6. Seefeldt A.C., Graf M, Perebaskine N, Nguyen F, Arenz S, Mardirossian M, Scocchi M, Wilson D.N., Innis C.A. (2016). Structure of the mammalian antimicrobial peptide Bac7(1–16) bound within the exit tunnel of a bacterial ribosome. Nucleic Acids Research. 44 (5), 2429-2438. DOI: 10.1093/nar/gkv1545 PubMedID: 26792896
    7. Seefeldt A.C., Nguyen F., Antunes S, Perebaskine N, Graf M, Arenz S, Inampudi K.K., Douat C, Guichard G, Wilson D.N., Innis C.A. (2015). The proline-rich antimicrobial peptide Onc112 inhibits translation by blocking and destabilizing the initiation complex.. Nature Structural and Molecular Biology. 22 (6), 470-475. DOI: 10.1038/nsmb.3034 PubMedID: 25984971
    8. Starosta A.L., Lassak J, Peil L, Atkinson G.C., Virumäe K, Tenson T, Remme J, Jung K, Wilson D.N. (2014). Translational stalling at polyproline stretches is modulated by the sequence context upstream of the stall site.. Nucleic Acids Research. 42 (16), 10711-10719. DOI: 10.1093/nar/gku768 PubMedID: 25143529
    9. Ude S, Lassak J, Starosta A.L., Kraxenberger T, Wilson D.N., Jung K (2013). Translation elongation factor EF-P alleviates ribosome stalling at polyproline stretches.. Science. 339 (6115), 82-85. DOI: 10.1126/science.1228985 PubMedID: 23239623
    10. Wensel D, Sun Y, Li Z, Zhang S, Picarillo C, McDonagh T, Fabrizio D, Cockett M, Krystal M, Davis J (2017). Discovery and Characterization of a Novel CD4-Binding Adnectin with Potent Anti-HIV Activity.. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (8), DOI: 10.1128/AAC.00508-17 PubMedID: 28584151
    11. Xian F, Li S, Liu S (2015). Rapid biosynthesis of stable isotope-labeled peptides from a reconstituted in vitro translation system for targeted proteomics.. Methods in Enzymology. 565, 347-366. DOI: 10.1016/bs.mie.2015.07.013 PubMedID: 26577738
    12. Ude, S., J. Lassak, et al. (2013). Translation Elongation Factor EF-P Alleviates Ribosome Stalling at Polyproline Stretches. Science. 339(6115), 82-5. PubMedID: 23239623
    13. Zukher I, Novikova M, Tikhonov A, Nesterchuck M.V., Osterman I.A., Djordjevic M, Sergiev P.V., Sharma C.M., Severinov K (2014). Ribosome-controlled transcription termination is essential for the production of antibiotic microcin C.. Nucleic Acids Research. 42 (19), 11891-11902. DOI: 10.1093/nar/gku880 PubMedID: 25274735
    14. Arenz S, Bock L.V., Graf M, Innis C.A., Beckmann R, Grubmüller H, Vaiana A.C., Wilson D.N. (2016). A combined cryo-EM and molecular dynamics approach reveals the mechanism of ErmBL-mediated translation arrest.. Nature Communications. 7, 12026. DOI: 10.1038/ncomms12026 PubMedID: 27380950
    15. Cui Z, Stein V, Tnimov Z, Mureev S, Alexandrov K (2015). Semisynthetic tRNA Complement Mediates in vitro Protein Synthesis. Journal of the American Chemical Society. 137 (13), 4404-4413.
    16. Doerfel L.K., Wohlgemuth I, Kubyshkin V, Starosta A.L., Wilson D.N., Budisa N, Rodnina M.V. (2015). Entropic Contribution of Elongation Factor P to Proline Positioning at the Catalytic Center of the Ribosome. Journal of the American Chemical Society. 137 (40), 12997-13006. DOI: 10.1021/jacs.5b07427 PubMedID: 26384033
    17. Fleming S.R., Bartges T.E., Vinogradov A.A., Kirkpatrick C.L., Goto Y, Suga H, Hicks L.M., Bowers, A.A. (2019). Flexizyme-Enabled Benchtop Biosynthesis of Thiopeptides.. Journal of the American Chemical Society. 141 (2), 758-762. DOI: 10.1021/jacs.8b11521 PubMedID: 30602112
    18. Gan Q, Fan C Increasing the fidelity of noncanonical amino acid incorporation in cell-free protein synthesis. Biochimica et Biophysica Acta – General Subjects. 3047-3052. DOI: 10.1016/j.bbagen.2016.12.002 PubMedID: 27919800
    19. Glover W.B., Mash D.C., Murch S.J. (2014). The natural non-protein amino acid N-beta-methylamino-L-alanine (BMAA) is incorporated into protein during synthesis. Amino Acids. 46 (11), 2553-2559.
    20. Hamadani K.M., Howe J, Jensen M.K., Wu P, Cate J.H.D., Marquee S (2017). An in vitro tag-and-modify protein sample generation method for single-molecule fluorescence resonance energy transfer.. The Journal of Biological Chemistry. 292 (38), 15636-15648. DOI: 10.1074/jbc.M117.791723 PubMedID: 28754692

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Protein Synthesis Reaction using PURExpress® ∆ (aa, tRNA) Kit (E6840)
    2. Analysis of Synthesized Protein using PURExpress (E6840)
    3. Measurement of 35S-Methionine Incorporation by TCA Precipitation and Yield Determination using PURExpress
    4. Determination of Protein Synthesis Yield with PURExpress (E3313, E6800, E6840, E6850)
    5. Purification of Synthesized Protein using Reverse His-tag Purification

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE6800_E3313_E6840_E6850

  • 应用实例

    • Scaling down to scale up Miniaturizing cell free protein synthesis reactions with the Echo 525 Acoustic Liquid Handler

工具 & 资源

  • 选择指南

    • Protein Expression and Purification Selection Chart

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. How is the Δ aa Δ tRNA Kit E6840S different from the PURExpress E6800S kit?
    2. When using PURExpress, I was unable to synthesize the control protein?
    3. When using PURExpress, I was able to synthesize the target protein, but full-length product is not major species?
    4. When using PURExpress, I was able to synthesize the control protein, but the target sample is not present or present in low yield?
    5. Where can I find many more detailed FAQs for PURExpress?
    6. Are there PURExpress citations?

  • 实验技巧

    在冰上融化试剂和建立反应体系
    使用前，请将溶液 A 和 B 充分混合。不要涡旋溶液 B 或核糖体，将其轻轻混合。
    溶液 A 可能呈浑浊白色。以均匀悬浮状态加入到反应中。
    在冰上按下列加样顺序建立反应体系：溶液 A、溶液 B、RNAse 抑制剂、水、模板 DNA 或 RNA
    建立反应体系后，要确保所有试剂都充分混合，可以轻柔地上下吸打混匀并进行短暂瞬时离心，37℃条件下温育 2 到 4 小时。

PURExpress® Δ RF123 试剂盒 |NEB酶试剂 New England Biolabs

发表于由

上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

PURExpress®  体外蛋白合成试剂盒是新型无细胞转录/翻译体系，用于基因快速表达分析，是由大肠杆菌翻译所必需组份纯化而构成。PURExpress 体系无核酸酶和蛋白酶的污染，保护了 DNA 和 RNA模板/复合体，避免了蛋白的修饰及降解。转录和翻译过程仅需将两管试剂混合，一步反应即可完成，几个小时内即可获得实验结果，PURExpress 体系大大地节省了宝贵的实验时间，是用于高通量技术的理想选择。

PURExpress 文献引用

图 1：使用 PURExpress® 体外蛋白合成试剂盒的表达蛋白。 PURExpress® Δ RF123 试剂盒 |
在 25 μl 反应体系中加入 250 ng 模板 DNA 和 20 单位 RNase 抑制剂，37℃ 温育 2 小时。各取 2.5 μl 反应液使用 10 – 20% Tris-甘氨酸凝胶进行 SDS-PAGE 电泳分析。红点处指示为目的蛋白。Marker M 是蛋白质分子量标准（NEB #P7703 已停产，被 NEB #P7717 替代）。
图 2：添加 35S-甲硫氨酸通过放射自显影显示蛋白。 PURExpress® Δ RF123 试剂盒 |
在 25 μl 反应中加入 250 ng 模板 DNA、20 单位 RNase 抑制剂以及 2 μl 35S-甲硫氨酸，37℃ 温育 2 小时。各取 2.5 μl 反应液进行 SDS-PAGE 电泳分析，将凝胶固定 10 分钟，80℃干燥 2 小时，并在 -80℃ 条件下使用 x 射线胶片曝光 5 小时。
图 3：使用 PURExpress 体系进行蛋白合成和纯化示意图。 PURExpress® Δ RF123 试剂盒 |
图 4：使用 PURExpress 体系表达和反向纯化 DHFR（A）和 T4 DNA 连接酶（B）。 PURExpress® Δ RF123 试剂盒 |
根据随附产品说明书中的建议，使用 125 μl 的反应体系。样本使用经考马斯亮蓝染色的 10 – 20% Tris-甘氨酸凝胶进行分析。在这两种情况下，目的蛋白都可以在总蛋白质的条带中可见。红点处指示为目的蛋白。Marker M 是蛋白质分子量标准（NEB #P7703 已停产，被 NEB #P7717 替代）。
产品类别:
PURExpress,
Cell-Free Protein Expression Products,
Protein Expression Products

应用:
PURExpress,
Cell-Free Protein Expression,
Protein Expression

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E6850S     -80    
        Solution A (E6850) B0229AVIAL -80 1 x 0.1 ml 2.5 X
        PURExpress Solution B (Minus RF123) P6854AVIAL -80 1 x 0.075 ml Not Applicable
        RF1 (10 μl) P6851AVIAL -80 1 x 0.01 ml Not Applicable
        RF2 (10 μl) P6852AVIAL -80 1 x 0.01 ml Not Applicable
        RF3 (10 μl) P6853AVIAL -80 1 x 0.01 ml Not Applicable
        PURExpress Control DHFR Plasmid N0424AVIAL -20 1 x 0.01 ml 125 ng/µl

  • 特性和用法

    需要但不提供的材料

    • 一般条件：37℃温育
    • 标记：35S-甲硫氨酸（建议 > 1000 Ci/mmol，体外翻译级）
    • TCA 沉淀：TCA 溶液（25%、10%）、1 M NaOH、酪胺酸、乙醇、玻璃纤维过滤器、真空过滤歧管
    • SDS-PAGE：凝胶和电泳缓冲液、凝胶装置、电源、凝胶干燥器
    • 蛋白免疫印迹法：转移装置、膜、抗体和检测试剂
    • 纯化：Ni-NTA 琼脂糖、Amicon Ultra- 0.5 ml、Ultracel- 100K 膜离心过滤器

  • 优势和特性

    应用特性

    • 快速合成用于蛋白质特性研究的分析量级别的样本
    • 确认开放阅读框
    • 检测突变对 ORF 的影响
    • 合成具有活性和功能域的截短蛋白
    • 掺入修饰的、非天然的或标记的氨基酸
    • 绘制抗原表位图谱
    • 毒性蛋白表达
    • 核糖体展示
    • 翻译和/或蛋白折叠研究
    • 体外区域化

  • 相关产品

    相关产品

    • PURExpress® Δ (aa, tRNA) 试剂盒
    • PURExpress® 体外蛋白合成试剂盒
    • PURExpress® 二硫键增强剂
    • 小鼠 RNase 抑制剂
    • PURExpress® Δ Ribosome 试剂盒
    • E. coli 核糖体

  • 注意事项

    1. 阳性对照反应中，加入 2 μl 对照（DHFR）模板以及随附的每个释放因子各 0.5 μl。
    2. 每个试剂盒提供的试剂足够进行 10 次反应（25 µl 反应体系/次）。
    3. 该试剂盒单独提供三种释放因子，用户能够自行选择在有或无释放因子的条件下进行蛋白质合成/核糖体展示实验。
    4. 释放因子没有添加在溶液 B 中。根据您的实验和蛋白质模板设计，您可能仍然会观察到一个低水平的翻译终止过程。
    5. PURExpress DHFR 对照模板序列文件：Fasta、GenBank

  • 参考文献

    1. Hong, S. H., I. Ntai, et al. (2013). Cell-free Protein Synthesis from a Release Factor 1 Deficient Escherichia coli Activates Efficient and Multiple Site-specific Nonstandard Amino Acid Incorporation. ACS Synthetic Biology. 3(6), 398-409. PubMedID: 24328168
    2. Kogure, H., Y. Handa, et al. (2013). Identification of residues required for stalled-ribosome rescue in the codon-independent release factor YaeJ. Nucleic Acids Research. 42(5), 3152-63. PubMedID: 24322300

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Analysis of Synthesized Protein using PURExpress (E6850)
    2. Determination of Protein Synthesis Yield with PURExpress (E3313, E6800, E6840, E6850)
    3. Protein Synthesis Reaction using PURExpress® ∆ RF123 Kit (E6850)
    4. Purification of Synthesized Protein using Reverse His-tag Purification
    5. Measurement of 35S-Methionine Incorporation by TCA Precipitation and Yield Determination using PURExpress

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE6800_E3313_E6840_E6850

  • 应用实例

    • Scaling down to scale up Miniaturizing cell free protein synthesis reactions with the Echo 525 Acoustic Liquid Handler

工具 & 资源

  • 选择指南

    • Protein Expression and Purification Selection Chart

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. How is the ΔRF123 Kit E6850S different from the PURExpress E6800S kit?
    2. Where can I find many more detailed FAQs for PURExpress?
    3. When using PURExpress, I was unable to synthesize the control protein?
    4. When using PURExpress, I was able to synthesize the target protein, but full-length product is not major species?
    5. When using PURExpress, I was able to synthesize the control protein, but the target sample is not present or present in low yield?
    6. Are there PURExpress citations?

  • 实验技巧

    在冰上融化试剂和建立反应体系
    使用前，请将溶液 A 和 B 充分混合。不要涡旋溶液 B 或核糖体，将其轻轻混合。
    溶液 A 可能呈浑浊白色。以均匀悬浮状态加入到反应中。
    在冰上按下列加样顺序建立反应体系：溶液 A、溶液 B、RNAse 抑制剂、水、模板 DNA 或 RNA
    建立反应体系后，要确保所有试剂都充分混合，可以轻柔地上下吸打混匀并进行短暂瞬时离心，37℃条件下温育 2 到 4 小时。