磁珠型microRNA分离试剂盒

FUJIFILM Wako提供能使从Ago 免疫沉淀到RNA 提取等一系列实验操作简化的“microRNA Isolation Kit”系列。使用本系列试剂盒能简便地从人和小鼠的细胞或组织中提取Ago蛋白结合的microRNA以及靶mRNA，还能从培养上清、血清、血浆中提取游离Ago蛋白结合的microRNA。所提取到的RNA可以应用于qPCR、微阵列检测、NGS等下游实验。本系列包括采用磁珠的MagCapture™ microRNA Isolation Kit，以及采用了硅胶珠法的microRNA Isolation Kit。

MagCapture™ microRNA Isolation Kit（磁珠法）系列产品包括含抗人Ago2抗体（4G8）、抗小鼠Ago2抗体（2D4）、抗Ago1-4抗体（1G3）固相化磁珠这三种试剂盒，以及第四种——能结合任意抗体的Protein G磁珠。上述试剂盒全部采用磁珠法，可进行简易的免疫沉淀操作并获得良好的重复性。免疫沉淀后提取的RNA可进一步使用离心柱纯化，获得高纯度的RNA；若使用含有抗Ago抗体固定化磁珠的3种试剂盒，也可使用一步法更加简便地提取RNA（备注：RNA与磁珠不分离）。

◆试剂盒组成（例：Human Ago2, 10次用）

  1.　Anti-Human Ago2 Magnetic Beads Solution：600 μL×1瓶

  2.　Cell Lysis Solution：20 mL×1瓶

  3.　Washing Solution for IP：40 mL×1瓶

  4.　Elution Solution I for IP：500 μL×1瓶

  5.　Elution Solution II for IP：500 μL×1瓶

  6.　Binding Solution for Spin Column：2 mL×1瓶

  7.　Binding Enhancer for Spin Column：100 μL×1瓶

  8.　Washing Solution I for Spin Column：3 mL×1瓶

  9.　Washing Solution II for Spin Column：4 mL×1瓶

10.　Elution Solution for Spin Column：1 mL×1瓶

11.　Spin Column/Collection Tube：10瓶

◆操作示意图

◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit，Human Ago2 使用例子（人）

提取人细胞株中的microRNA

通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（银染），检测使用本品（MagCapture™ microRNA Isolation Kit，Human Ago2）从人K562细胞（1×10⁷ cells）中提取的microRNA（图1）。结果显示，本系列试剂盒可提取得到高纯度的microRNA。通过qPCR对miR-92a进行定量，比较使用本品和硅胶珠型产品（microRNA Isolation Kit，Human Ago2）提取的microRNA量（图2）。本系列试剂盒的离心柱法具有几乎与硅胶珠法相同的microRNA提取能力，而且一步法的microRNA提取能力比硅胶珠法更好。

图1.　对从人K562细胞中提取的microRNA的进行银染检测

图2.　比较从人K562细胞中提取的microRNA量

提取人血浆中的游离Ago2蛋白结合microRNA

以qPCR对miR-92a进行定量，比较使用磁珠型MagCapture™ microRNA Isolation Kit，Human Ago2和硅胶珠型产品从200 μL健康人混合血浆中提取的microRNA量。结果发现，本试剂盒中的离心柱法具有几乎与硅胶珠型产品相同的microRNA提取能力，而且一步法的microRNA提取量比硅胶珠型高（图3）。

图3.　比较从人血浆中提取的microRNA量

提取microRNA的靶标mRNA

向miR-122低表达的肝癌细胞株HepG2细胞（5×10⁵ cells）导入人工合成的miR-122或调控的荧光素酶siRNA（Luc siRNA），提取了分别用磁珠型MagCapture™ microRNA Isolation Kit，Human Ago2和硅胶珠型产品制备的Ago2 IP RNA，以及用ISOGEN^® 制备的total RNA。运用qPCR法比较各种RNA中含有的miR-122量（图4）与其靶标mRNA（Aldo A mRNA是miR-122靶标之一，以GAPDH内参作校正）量（图5）。与硅胶珠型产品一样，本品提取的RNA中富集了miR-122和Aldo A mRNA，因此，可以利用本品提取microRNA的靶标mRNA。另一方面，用ISOGEN^® 制备的total RNA中的Aldo A mRNA会随着miR-122的增加而分解并减少。

图4.　miR-122提取量的比较

图5.　靶标mRNA提取量的比较

◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2 使用例子（小鼠）

从小鼠细胞株中提取microRNA

通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（银染），检测用本试剂盒（MagCapture™ microRNA Isolation Kit，Mouse Ago2）从小鼠P388D1细胞（2×10⁷ cells）中提取的microRNA（图1）。结果显示，本品能提取出高纯度的microRNA。另外，以qPCR法对miR-92a进行定量，比较使用硅胶珠型产品（microRNA Isolation Kit，Mouse Ago2）提取到的microRNA量（图2）。结果发现，本品的离心柱法具有与硅胶珠型产品几乎同样的microRNA提取能力，而一步法的microRNA提取能力比硅胶珠型产品更好。

图1.　对从小鼠P388D1细胞中提取的microRNA的进行银染检测

图2.　比较从小鼠P388D1细胞中提取的microRNA量

从大鼠血浆中提取游离Ago2蛋白结合microRNA

通过qPCR对miR-92a进行定量，比较使用本品以及硅胶珠型产品从200μL大鼠血浆中提取到的microRNA量。本品的离心柱法具有与硅胶珠型产品几乎同样的microRNA提取能力，而一步法的microRNA提取能力比硅胶珠型产品更好（图3）。

图3.　比较从大鼠血浆中提取的microRNA量

◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Ago 1–4 使用例子（人）

提取Ago1–4结合microRNA

用各种Ago1、Ago2、Ago3、Ago4特异性抗体进行微阵列检测分析免疫沉淀后HeLa中的各个RNA组分，结果显示，Ago2中捕获了大量miR-22和miR-16，而Ago1、Ago3、Ago4中则捕获了大量的miR-1260b和miR-4286（表1）。

	信号强度				信号比
名称	Ago1 IP	Ago2 IP	Ago3 IP	Ago4 IP	Ago2/Ago1	Ago2/Ago3	Ago2/Ago4
hsa-miR-22	3521.4	21696.5	3771.2	292.4	6.16	5.75	74.2
hsa-miR-16	6886.3	28527.2	5013.4	582.5	4.14	5.69	48.97
hsa-miR-1260b	2060.3	540.9	1270.6	1977.9	0.26	0.43	0.27
hsa-miR-4286	678.8	202.4	2019.2	471.2	0.3	0.1	0.43

表1.　微阵列检测分析结果

上述分析结果验证了我们可以利用MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Ago1-4，从Ago1、Ago3、Ago4中提取硅胶珠型产品难以提取的大量microRNA。

使用本品和硅胶珠型产品，提取HeLa细胞（1×10⁷ cells）中的microRNA，以miR-92a作为内部标准，通过qPCR检测miR-22、miR-1、miR-1260b、miR-4286的提取量。结果发现，Ago1、Ago3、Ago4中miR-1260b、miR-4286的提取量比硅胶珠型产品更高（图1）。因此，本品不仅能提取Ago2中的microRNA，还能从Ago1、Ago3、Ago4中提取硅胶珠型产品难以提取的大量microRNA。

图1.　比较从HeLa细胞中提取的各种microRNA量

提取人和小鼠细胞株中的microRNA

以qPCR对miR-92a进行定量，比较用本品和硅胶珠型产品（microRNA Isolation Kit, Human Ago2或Mouse Ago2）从人K562细胞（1×10⁷ cells）及小鼠P388D1细胞（2×10⁷ cells）中提取的microRNA量。结果显示，本品可提取和硅胶珠型产品相同甚至更多的microRNA（图2，3）。

图2.　比较从人K562细胞中提取的microRNA量

图3.　比较从小鼠P388D1细胞中提取的microRNA量

提取人和大鼠血浆中的游离Ago结合microRNA

以qPCR对miR-92a进行定量，比较用本品和第一代产品（microRNA Isolation Kit, Human Ago2或Mouse Ago2）从200 μL人以及大鼠血浆中提取的microRNA量。结果显示，本品可提取和硅胶珠型产品相同甚至更多的microRNA（图4,5）。

图4.　比较从人血浆中提取的microRNA量

图5.　比较从大鼠血浆中提取的microRNA量

提取各种动物细胞株中的microRNA

以qPCR对miR-92a进行定量，检测用MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Human Ago2、Mouse Ago2、Ago1-4从2×10⁶ cells的K562细胞（人）、COS-7细胞（猴）、MDCK细胞（狗）、P388D1细胞（小鼠）、SCC-131细胞（大鼠）中提取的免疫沉淀组分中的microRNA量，和用ISOGEN^® 从各种细胞中提取的total RNA组分中的microRNA量。通过比较各种免疫沉淀所得到的RNA组分中的miR-92a量和total RNA组分中的miR-92a量的相对值，表明本品适合提取上述全部细胞中的microRNA（图6）。

图6.　比较从各种动物细胞中提取的microRNA量

◆MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Protein G使用例子

提取人和小鼠细胞株中的microRNA（与硅胶珠型产品的比较）

以qPCR法对miR-92a进行定量，比较用本品（MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Protein G）和抗Ago1抗体（2A7）、抗人Ago2抗体（4G8）、抗人Ago3抗体（1C12）从人K562细胞（1×10⁷ cells）提取的microRNA量，和用硅胶珠型产品（microRNA Isolation Kit, Human/Mouse Ago1、Human Ago2、Human Ago3）提取的micro RNA量（图1,2,3,）。另外，以qPCR对miR-92a进行定量，比较用本品和抗小鼠Ago2抗体（2D4）从小鼠P388D1细胞（2×10⁷ cells）中提取的microRNA量，和用硅胶珠型产品（microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2）提取的microRNA量（图4）。结果发现，本品与任意抗Ago抗体结合使用，能比硅胶珠型产品提取到更多的microRNA。

图1.　比较结合了抗Ago1抗体时的microRNA提取量

图2.　比较固定抗人Ago2抗体时的microRNA提取量

图3.　比较固定抗人Ago3抗体时的microRNA提取量

图4.　比较固定抗小鼠Ago2抗体时microRNA的提取量

提取人与小鼠细胞株中各种Ago蛋白结合microRNA

通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和qPCR，对用本品和抗Ago1抗体（2A7）、抗人Ago2抗体（4G8）、抗人Ago3抗体（1C12）、抗Ago4抗体（2G7)从人K562细胞（1×10⁷ cells）中提取的miR-92a表达量进行检测（图5）。另外，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和qPCR（miR-92a量），检测用本品和抗Ago1抗体（2A7）、抗小鼠Ago2抗体（2D4）、抗小鼠Ago3抗体（S09）、抗Ago4抗体（2G7)从小鼠P388D1细胞（2×10⁷ cells）中提取的microRNA量（图6）。结果表明，本品与任意的抗Ago抗体组合使用，能提取与各种Ago结合的microRNA。

图5.　从人K562细胞中提取的microRNA量的比较与银染检测

图6.　从小鼠P388D1细胞中提取的microRNA量的比较与银染检测

◆产品列表

产品编号	产品名称	使用 抗体 克隆号	对应 物种	对应样本	提取RNA	IP   B/F 分离法	RNA 提取法
295-74001	MagCapture™ microRNA Isolation Kit, Human Ago2 MagCapture™ microRNA 分离试剂盒，人Ago2	4G8	人、猴、狗	细胞/ 组织 血清/ 血浆	microRNA 靶标mRNA	磁力 分离	离心 柱法 一步法
297-74201	MagCapture™ microRNA Isolation Kit，Mouse Ago2 MagCapture™ microRNA 分离试剂盒，小鼠Ago2	2D4	小鼠、大鼠、狗
293-74801	MagCapture™ microRNA Isolation Kit，Ago 1-4 MagCapture™ microRNA 分离试剂盒，Ago1-4	1G3	人、猴、狗、小鼠、大鼠		microRNA
299-74401	MagCapture™ microRNA Isolation Kit，Protein G MagCapture™ microRNA 分离试剂盒，蛋白G	随意 选择	根据使用的抗体而定	细胞/ 组织	根据使用的抗体而定		一步法

※ 本页面产品仅供研究用，研究以外不可使用。

microRNA 增强试剂盒

microRNA Booster Kit

◆产品概况

　　Stemgent^® microRNA Booster 试剂盒增强和简化了 mRNA 的重编程，可用正常或者病人特定类型细胞制备有效的 iPS 细胞系。 microRNA Booster 试剂盒包括 microRNA 重编程混合物和 B18R 重组蛋白。

　　microRNA 增强型 mRNA 重编程方法改进了第一代 mRNA 重编程试剂盒，递送更快速的重编程动力学，流水线操作，提供了难以进行重编程类型细胞的重编程效率。 microRNA-增强型方法是 Stemgentm^® RNA Reprogramming Kit 和 microRNA Booster Kit、Stemfect™ RNA Transfection Kit 配套使用，至少８天内获得原代 iPS 细胞克隆。该新方法改进了动力学，减少了每次转染 mRNA 的剂量，与基于饲养层细胞 mRNA 重编程方法相比，每个孔减少大约 35%~45% 的 mRNA 量。

◆优势

	Stemgent® mRNA 重编程方法	Stemgent® microRNA 增强型 mRNA 重编程方法
重编程效率	>１%	>１%
快速重编程动力学	是	是
体细胞 → iPS 细胞	３周	２周
插入突变风险	无	无
病毒清除筛选	无	无
DNA 载体保留和/或者整合的筛选	无	无
与运用病毒相关的生物污染问题	无	无
# 每个试剂盒的孔数 of wells per kit（６孔板）	4	9-10（35%-45% /孔节省用量）
重编程底物	成纤维细胞饲养层	细胞外基质
难以重编程和重塑的细胞类型	—	是
简单，友好的操作流程 (过夜转染)	—	是

◆案例・应用

	Figure 1：MicroRNA 增强型 mRNA 重编程实验时间轴。 Stemgent® microRNA 增强型 mRNA 重编程实验步骤已经经过优化，确保在２周时间内制备人 iPS 细胞并可以传代。
	Figure 2：mRNA 重编程实验时间轴。TStemgent RNA 重编程实验流程优化确保在３周内制备人 iPS 细胞并可以传代。
	Figure 3：使用 Stemgent-Asterand microRNA 增强型重编程系统制备人 iPS 细胞的时空图片。相差显微镜图片显示第１天细胞的形态。用 Stemgent-Asterand microRNA 增强型重编程系统制备人 iPS 细胞的时空图片。相差显微镜图片显示第１天细胞的形态。
	Figure 4：使用 Stemgent-Asterand microRNA 增强型重编程系统制备人 iPS 细胞的时空图片。相差显微镜图片显示第３天细胞的形态。
	Figure 5：使用 Stemgent-Asterand microRNA 增强型重编程系统制备人 iPS 细胞的时空图片。相差显微镜图片显示第５天细胞的形态。
	Figure 6：使用 Stemgent-Asterand microRNA 增强型重编程系统制备人 iPS 细胞的时空图片。相差显微镜图片显示第７天细胞的形态。
	Figure 7：使用 Stemgent-Asterand microRNA 增强型重编程系统制备人 iPS 细胞的时空图片。相差显微镜图片显示第９天细胞的形态。
	Figure 8：使用 Stemgent-Asterand microRNA 增强型重编程系统制备人 iPS 细胞的时空图片。相差显微镜图片显示第 12 天细胞的形态。
	Figure 9：使用 Stemgent-Asterand microRNA 增强型重编程系统制备人 iPS 细胞的时空图片。第 12 天，用 TRA-1-81（多能性标记物）荧光染色 iPS 细胞。

◆相关产品

货号	名称	规格
00-0073	microRNA Booster Kit microRNA增强试剂盒	1 kit
00-0071	Stemgent® mRNA Reprogramming Kit  mRNA 重编程试剂盒	1 kit
00-0075	Stemgent® StemRN™ SR Reprogramming Kit StemRNATM-SR重编程试剂盒	1 kit

注：本品已停产，升级版本已推出：Stemgent^® StemRNA™ 3rd Generation Reprogramming Kit（又名 StemRNA-NM Reprogramming Kit，产品编号：00-0076）。

试剂盒成分

●　2 瓶 – microRNA Reprogramming 混合物Ⅰ（20 μM）（货号 05-0036），35 μL

●　B18R 重组蛋白，不含载体（货号. 03-0017），50 μg

 

保存和保质期 Storage and Stability

●　将 microRNA 重编程混合物和 B18R 蛋白保存在 -70℃以下。

●　按照指示的保存，收到货后至少可以保存３个月。

 

质量控制

 Stemgent^® microRNA Booster 试剂盒用人新生的包皮成纤维细胞成功进行基于 RNA 重编程。所有试剂盒组分都灭过菌，检测不含支原体。

推荐使用

●　Stemgent^® microRNA Booster Kit 用于 microRNA-增强型 mRNA 重编程

●　参考制备 NuFF-条件性 Pluriton 培养基用于制备条件性重编程培养基。

●　参考操作手册： Stemgent^® mRNA 重编程系统，关注实验细节和材料处理。

Specification Sheets

 00-0073 Product Specification Sheet

Safety Data Sheets

03-0017 Safety Data Sheet

00-0073 Safety Data Sheet

05-0036 Safety Data Sheet

Protocols

   microRNA Enhanced mRNA Reprogramming

Application Notes

     MicroRNA Application Note

Product Sheets

      Product Sheet_RNA Reprogramming

 

Related Products

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        TRA-1-81 Antibody (DyLight™ 488), Mouse anti-Human (09-0069)

        Nanog Antibody (Affinity Purified), Rabbit anti-Mouse/Human (09-0020)

  Oct4 Antibody (Affinity Purified), Rabbit anti-Mouse/Human (09-0023)

        SSEA-4 Antibody (Purified), Mouse anti-Human (09-0006)

        TRA-1-60 Antibody (Purified), Mouse anti-Human (09-0010)

        TRA-1-81 Antibody (Purified), Mouse anti-Human (09-0011)

        mRNA Reprogramming Factors Set: hOKSML (00-0067)

 

Additional Publications

7q11.23 dosage-dependent dysregulation in human pluripotent stem cells affects transcriptional programs in disease-relevant lineages

Josowitz R, Lu J, Falce C, D’Souza SL, Wu M, Cohen N, Dubois NC; Zhao Y; Sobie EA; Fishman GI; Gelb BD. Identification and purification of human induced pluripotent stem cell-derived atrial-like cardiomyocytes based on sarcolipin expression. PLoS ONE 9(7): e101316 (2014)

 Briggs SF; Dominguez AA; Chavez SL; Reijo Pera RA. "XIST in human preimplantation embryos and iPSCs." Stem Cells 33:1771 (2015)