标签归档：gate

Golden Gate 组装预混液 |NEB酶试剂 New England Biolabs

发表于由

上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

NEB Golden Gate 组装预混液是 BsaI 和 T4 DNA 连接酶的优化预混液。这些酶与全面优化的缓冲液结合起来使用，可通过 Golden Gate 方法进行多个插入片段/模块的组装。试剂盒还随附目的质粒 pGGA，为组装提供骨架，同时为亚克隆提供限制性内切酶酶切位点，以及为体外转录提供 T7/SP6 启动子序列。

Golden Gate 组装技术（1,2）起源于 1996 年，当时是第一次使用 IIS 型限制性内切酶和 T4 DNA 连接酶依次（3）或同时（4）将多个目的基因插入到同一个载体骨架上。

IIS 型限制性内切酶结合于识别位点，却在识别位点的下游特定位置进行切割，切割位点是位置特异的，而非序列特异的。这样，单个 IIS 型限制性内切酶可用于产生具有特定突出末端的 DNA 片段。例如，BsaI 的识别位点为 GGTCTC（N1/N5），其中 GGTCTC 是识别和结合位点，而 N1/N5 表示切割位点位于上链的第一个碱基后，下链的第五个碱基后。片段的连接是通过酶切产生的 4 个碱基突出端互补而形成。酶切后的片段及最终组装产物不再含有 IIS 型限制性内切酶识别位点，所以不可能进一步发生酶切。 组装产物随时间逐渐积累。

Golden Gate 方法特别适用于多重组装实验，例如 TALEs（Transcription Activator Like Effectors，转录激活因子样效应物）（5），以及 TALENs（TALE 与 FokI 核酸酶催化结构域融合表达）（6）。此方法也可用于克隆单插入片段。观看此视频教程，了解更多 Golden Gate 组装工作流程。

为帮助您选择最佳 DNA 组装方法，请参考合成生物学/DNA 组装选择指南。

图 1：概述：Golden Gate 组装的操作流程
Golden Gate 组装预混液 |
Golden Gate 组装预混液 |
图 2：Golden Gate 工作流程 Golden Gate 组装预混液 |
简单来说，Golden Gate 组装需要 IIS 型内切酶识别位点，在本示例中，BsaI 识别序列（GGTCTC）加在 dsDNA 片段双侧末端。酶切后，识别位点不再存在，每个片段产生 4 个碱基突出末端，用于引导组装。
图 3：NEB Golden Gate 组装预混液可实现优质组装Golden Gate 组装预混液 |
组装反应体系直接使用预克隆的插入片段或 PCR 扩增子。反应条件根据如上所示的厂商说明书建立。每种反应类型均进行了两次独立的实验。
Golden Gate 组装预混液 |
上图展示了 pGGA 质粒的特性，包括组装后被切除和替代的表达框。唯一的限制性酶切位点用黑色字表示。扩展框标明了用于测序或菌落 PCR 分析引物的位置、启动子区域、附加限制性酶切位点、载体骨架经 BsaI 酶切后产生的四碱基突出端以及表达框的序列。
产品类别:
DNA Assembly, Cloning and Mutagenesis Kits Products

应用:
DNA Assembly and Cloning,
High-throughput cloning and automation solutions,
NEBridge® Golden Gate Assembly

  • 特性和用法

    需要但不提供的材料

    • 用户自备的插入片段
    • 感受态细胞
    • 其它转化试剂

  • 优势和特性

    Features

    • 无缝克隆 – 组装后无额外碱基存在
    • 单次反应即可按顺序组装多个片段
    • 也可用于单个片段克隆
    • 有效组装高 GC 区和重复区
    • 兼容片段长度广（< 100 bp to > 15 kb）
    • 登陆 GoldenGate.neb.cn 使用免费的在线工具

  • 相关产品

    相关产品

    • Quick-Load® 紫色 1 Kb Plus DNA Ladder
    • Q5® 热启动超保真 2X 预混液
    • Q5® 热启动超保真 DNA 聚合酶
    • dNTP 混合液
    • Q5® 定点突变试剂盒
    • Q5® 定点突变试剂盒（不含感受态细胞）
    • NEB® 10-beta E. coli 感受态细胞（高效级）
    • NEB® 5-alpha E. coli 感受态细胞（高效级）
    • NEB® Turbo E. coli 感受态细胞（高效级）
    • NEB® Stable E. coli 感受态细胞（高效级）
    • NEB® 10-beta E. coli 电转感受态细胞
    • t1010-monarch-plasmid-miniprep-kit
    • Monarch® DNA 胶回收试剂盒
    • Monarch® PCR & DNA 纯化试剂盒（5 μg）
    • NEB® PCR 克隆试剂盒
    • NEB®  PCR 克隆试剂盒（不含感受态细胞）
    • T7 表达 E. coli 感受态细胞（高效级）

  • 参考文献

    1. Engler, C. et al (2008). PLoS ONE. 3: e3647.,
    2. Engler, C. et al (2009). PLoS ONE. 4: e5553.,
    3. Lee, J.H. et al (1996). Genetic Analysis: Biomolecular Engineering. 13; 139-145,
    4. Padgett, K.A. and Sorge, J.A. (1996). Gene. 168, 31-35.
    5. Weber, E. et al (2001). PLoS ONE. 6; e19722,
    6. Christian, M. et al (2010). Genetics. 186, 757-761.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Golden Gate Assembly Protocol for Using NEB Golden Gate Assembly Mix (E1600)
    2. Transformation Protocol for Using NEB Golden Gate Assembly Mix (E1600)
    3. Recommended Screening Protocols for Using NEB Golden Gate Assembly Mix (E1600)
    4. Golden Gate (24 Fragment) Assembly Protocol
    5. Golden Gate Assembly Protocol for Using NEBridge® Golden Gate Assembly Kit (BsaI-HF®v2) (E1601)
    6. Transformation Protocol for Using NEBridge® Golden Gate Assembly Kit (BsaI-HF®v2) (E1601)
    7. Recommended Screening Protocols for Using NEBridge® Golden Gate Assembly Kit (BsaI-HF®v2)

  • 应用实例

    • Breaking through the Limitations of Golden Gate Assembly

工具 & 资源

  • 选择指南

    • Synthetic Biology/DNA Assembly Selection Chart

  • Web 工具

    • NEBridge® Golden Gate Assembly Tool

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. What is the mechanism for Golden Gate Assembly?
    2. What affects the efficiency of Golden Gate Assembly?
    3. Can PCR amplicons be used directly in assembly reactions without purification?
    4. Why do many of the published Golden Gate Assembly articles feature precloned inserts as opposed to inserts generated by PCR?
    5. Using purified amplicons directly without precloning seems much easier, but is the assembly efficiency decreased?
    6. Will EDTA interfere with downstream BsaI restriction and ligation?
    7. Why is there a 55°C, 5 min heat step at the end of the assembly reaction?
    8. How can I minimize PCR-generated errors in my amplicon inserts?
    9. Can I use other competent E. coli strains than NEB 10-beta? Can I use subcloning efficiency cells?
    10. Why is Golden Gate also used for single insert cloning?
    11. Can the Golden Gate Assembly reactions be scaled down?
    12. I would like to use colony PCR to screen my transformants and sequence myassembly. Are there any recommended sequencing or colony PCR primers?
    13. I’m doing a moderate (4–5 insert) assembly but don’t have access to a thermal cycler. Can I use the simpler protocol using the 1 hr 37°C incubation?
    14. For amplicon inserts, why are the calculations suggested as using the overallpGGA destination plasmid length and the overall amplicon lengths? Shouldn’tonly the part of pGGA functioning as the vector backbone be used?

  • 实验技巧

    • 强烈推荐使用 NEB Golden Gate 组装工具（GoldenGate.neb.cn）；此工具可检查插入序列内部是否有 BsaI 位点，帮助设计引物扩增插入片段用于 Golden Gate 组装。设计的引物应在 BsaI 识别位点两侧的 5´ 端包含 7 个碱基、识别位点，以及有助于插入片段正确退火和连接的特定 4 碱基突出末端。所有突出末端将自动设计为非回文序列（以消除自插入连接）、唯一且方向正确，以确保正确组装。
    • 目前有两种基本的组装方案：37℃ 恒温温育，或在 37℃（既是保持连接酶稳定的温度范围，又是内切酶酶切的最佳温度）和 16℃（最佳连接温度）之间交替循环。组装方案选择建议以组装反应体系中的插入片段数量为准，但仍具有很大的灵活性；可以根据所需的组装效率和预定需求来匹配相应的方案。一般来说：a. 组装 1-4 个插入片段不需要循环；37℃ 恒温孵育即可。b. 对于多个插入片段，使用 1 分钟温度的循环组装即可。c. 对于较大规模组装（> 10 个插入片段）和任何需要最大组装效率和最大转化效率的组装来说，使用 5-10 分钟温育步骤的循环组装效果最佳。d. 无论有多少插入片段，只要条件允许，任何 Golden Gate 组装都可以在 37℃ 5 分钟 → 16℃ 10 分钟的条件下过夜完成 30 个循环；也就是说，使用较长的操作流程没有不利之处。
    • 应检查插入片段内部是否存在 BsaI 位点。（使用 NEB Golden Gate 组装工具时会自动完成此操作，goldengate.neb.cn）虽然内部有 BsaI 位点的插入片段仍可用于组装，但效率会比通过沉默突变去除内部位点的插入片段低。如果存在单个内部位点，则省略最后 55℃ 温育 5 分钟的步骤，以筛选更多菌落来鉴定正确的组装。
    • 对于插入片段的预克隆，推荐使用 NEB PCR 克隆试剂盒，因为该试剂盒的 pMiniT 2.0 载体骨架不存在 BsaI 位点。
    • 虽然 dcm 甲基化（序列 CCAGG 或 CCTGG 中胞嘧啶 C5 位置的甲基化）与酶切位点重叠阻断 BsaI 酶切，但这对于 Golden Gate 组装来说这通常不是问题。常用的目的载体设计为在 BsaI GGTCTC 识别位点前不包含上游 CC（A 或 T）碱基，以避免产生 dcm 甲基化与酶切位点重叠的情况。
    Golden Gate 组装中使用的限制性内切酶
     
    Golden Gate 组装预混液 |

ridge Golden Gate 组装试剂盒（BsaI-HF v2） |NEB酶试剂 New England Biolabs

发表于由

上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

NEBridge Golden Gate 组装试剂盒（BsaI-HFv2）内含优化的 BsaI-HFv2 和 T4 DNA 连接酶的混合液。利用 Golden Gate 方法，混合液可以完成多个片段/模块的组装。试剂盒还随附目的质粒 pGGAselect，为组装提供骨架，同时为亚克隆提供内切酶酶切位点，以及为体外转录提供 T7/SP6 启动子序列。

Golden Gate 组装技术（1,2）可高效、无痕地克隆组装 DNA 片段。该技术起源于 1996 年，当时是第一次使用单一的 IIS 型限制性内切酶和 T4 DNA 连接酶依次（3）或同时（4）将多个目的基因插入到同一个载体骨架上。

IIS 型限制性内切酶结合于识别位点，却在识别位点的下游特定位置进行切割，切割位点是位置特异的，而非序列特异的。这样，单个 IIS 型限制性内切酶可用于产生具有特定突出末端的 DNA 片段。例如，BsaI 的识别位点为 GGTCTC（N1/N5），其中 GGTCTC 是识别和结合位点，而 N1/N5 表示切割位点位于上链的第一个碱基后，下链的第五个碱基后。片段的连接是通过酶切产生的 4 个碱基突出端互补而形成。酶切后的片段及最终组装产物不再含有 IIS 型限制性内切酶识别位点，所以不可能进一步发生酶切。 组装产物随时间逐渐积累。

该方法特别适用于多重组装实验，例如 TALEs（Transcription Activator Like Effectors，转录激活因子样效应物）（5），以及 TALENs（TALE 与 FokI 核酸酶催化结构域融合表达）（6）。Golden Gate 方法也适用于单一目的基因的克隆实验以及不同来源基因的文库构建。观看此视频教程，了解更多 Golden Gate 组装工作流程。

为帮助您选择最佳 DNA 组装方法，请参考合成生物学/DNA 组装选择指南。

请注意，虽然 Golden Gate 组装中常用到 BsaI 内切酶，但 NEB 的试剂盒和操作步骤中则使用 BsaI-HFv2，该酶是原酶经过改造和优化的升级版。

图 1：概述：Golden Gate 组装的操作流程
ridge Golden Gate 组装试剂盒（BsaI-HF v2） |
图 2：Golden Gate 工作流程ridge Golden Gate 组装试剂盒（BsaI-HF v2） |
简单来说，Golden Gate 组装需要 IIS 型内切酶识别位点，在本示例中，BsaI-HFv2 识别序列（GGTCTC）加在 dsDNA 片段双侧末端。酶切后，识别位点不再存在，每个片段产生 4 个碱基突出末端，用于引导组装。
图 3：可高效精确地实现 24 个片段的 Golden Gate 组装ridge Golden Gate 组装试剂盒（BsaI-HF v2） |
遵循本文推荐的循环步骤，在含有 lacI/lacZ 的表达框中组装 24 个片段。虽然 30 个循环足以实现 24 个片段组装，但 BsaI-HFv2 和 T4 DNA 连接酶的稳定性允许连续进行 45 和 60 个循环的组装且背景低。（a）组装效率和（b）组装准确性与循环次数的关系如图所示。
图 4：

ridge Golden Gate 组装试剂盒（BsaI-HF v2） |

pGGA 是一个大小为 2,200 bp 的克隆载体，可用于 Golden Gate 组装。该质粒含有两个 BsaI 位点；用 BsaI 酶切会释放 87 bp 的片段和 2,133 bp 的载体骨架片段，可接收插入片段或组装片段。
产品类别:
DNA Assembly, Cloning and Mutagenesis Kits Products

应用:
DNA Assembly and Cloning,
High-throughput cloning and automation solutions,
NEBridge® Golden Gate Assembly

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E1601S     -20    
        NEBridge® Golden Gate Enzyme Mix (BsaI-HFv2) M2616AVIAL -20 1 x 0.02 ml Not Applicable
        T4 DNA Ligase Reaction Buffer B0202SVIAL -20 1 x 1 ml 10 X
        pGGAselect DNA N0309AAVIAL -20 1 x 0.1 ml 75 ng/µl
    • E1601L     -20    
        NEBridge® Golden Gate Enzyme Mix (BsaI-HFv2) M2616AAVIAL -20 1 x 0.1 ml Not Applicable
        T4 DNA Ligase Reaction Buffer B0202SVIAL -20 1 x 1 ml 10 X
        pGGAselect DNA N0309AAVIAL -20 1 x 0.1 ml 75 ng/µl

  • 特性和用法

    需要但不提供的材料

    • 用户自备的插入片段
    • 感受态细胞
    • 其它转化试剂

  • 优势和特性

    Features

    • 无缝克隆 – 组装后无额外碱基存在
    • 单次反应即可按顺序组装多个片段
    • 也可用于单个片段克隆
    • 有效组装高 GC 区和重复区
    • 兼容片段长度广（< 100 bp to > 15 kb）
    • 登陆 GoldenGate.neb.cn 使用免费的在线工具
    • 2 年保质期

  • 相关产品

    相关产品

    • Quick-Load® 紫色 1 Kb Plus DNA Ladder
    • Q5® 热启动超保真 2X 预混液
    • Q5® 热启动超保真 DNA 聚合酶
    • dNTP 混合液
    • Q5® 定点突变试剂盒
    • Q5® 定点突变试剂盒（不含感受态细胞）
    • NEB® 10-beta E. coli 感受态细胞（高效级）
    • NEB® 5-alpha E. coli 感受态细胞（高效级）
    • NEB® Turbo E. coli 感受态细胞（高效级）
    • NEB® Stable E. coli 感受态细胞（高效级）
    • NEB® 10-beta E. coli 电转感受态细胞
    • NEB® PCR 克隆试剂盒
    • NEB®  PCR 克隆试剂盒（不含感受态细胞）
    • T7 表达 E. coli 感受态细胞（高效级）
    • Nuclease-free Water
    • r3733-bsaI-hf-v2
    • Esp3I
    • BbsI-HF®
    • BsmBI-v2

  • 参考文献

    1. Engler, C. et al (2008). PLoS ONE. 3: e3647.
    2. Engler, C. et al (2009). PLoS ONE. 4: e5553.
    3. Lee, J.H. et al (1996). Genetic Analysis: Biomolecular Engineering. 13; 139-145.
    4. Padgett, K.A. and Sorge, J.A. (1996). Gene. 168, 31-35.
    5. Weber, E. et al (2001). PLoS ONE. 6; e19722.
    6. Christian, M. et al (2010). Genetics. 186, 757-761.
    7. Potapov, V. et al. (2018). Comprehensive Profiling of Four Base Overhang Ligation Fidelity by T4 DNA Ligase and Application to DNA Assembly. ACS Synth. Biol. 7, 11, 2665-2674. DOI: 10.1021/acssynbio.8b00333,

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Golden Gate Assembly Protocol for Using NEBridge® Golden Gate Assembly Kit (BsaI-HF®v2) (E1601)
    2. Transformation Protocol for Using NEBridge® Golden Gate Assembly Kit (BsaI-HF®v2) (E1601)
    3. Recommended Screening Protocols for Using NEBridge® Golden Gate Assembly Kit (BsaI-HF®v2)
    4. 52-Fragment Golden Gate Assembly using BsaI-HF®v2 (NEB #E1601)

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE1601

  • 使用指南

    • Expanded “assembly standards” for MoClo, GoldenBraid2.0 and other modular Golden Gate Assembly methods
    • Insert Considerations When Using NEBridge® Golden Gate Assembly Kit (BsaI-HFv2) (NEB #E1601)
    • Technical Tips For Optimizing Golden Gate Assembly Reactions

  • 应用实例

    • Breaking through the Limitations of Golden Gate Assembly
    • Accelerating DNA Construction to Protein Expression: A Rapid 1-Day Workflow Using NEBridge® Golden Gate Assembly 

工具 & 资源

  • 选择指南

    • Synthetic Biology/DNA Assembly Selection Chart

  • Web 工具

    • DNA Sequences and Maps Tool
    • NEBridge® Golden Gate Assembly Tool
    • NEBridge® Ligase Fidelity Tools

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Why does the Golden Gate Assembly Mix now feature BsaI-HFv2?
    2. What is the mechanism for Golden Gate Assembly?
    3. What affects the efficiency of Golden Gate Assembly?
    4. Why do many of the published Golden Gate Assembly articles feature precloned inserts as opposed to inserts generated by PCR?
    5. Using purified amplicons directly without precloning seems much easier, but is the assembly efficiency decreased?
    6. Can PCR amplicons be used directly in assembly reactions without purification?
    7. Why is Golden Gate also used for single insert cloning?
    8. What if there are internal BsaI and BsmBI sites in my insert sequences?
    9. Why do assembly reactions end with a 5 minute, 60°C incubation step?
    10. How can I minimize PCR-generated errors in my amplicon inserts?
    11. Can the Golden Gate Assembly reactions be scaled down?
    12. Can I use other competent E. coli strains than NEB 10-beta? Can I use subcloning efficiency cells?
    13. What is an appropriate negative control for Golden Gate Assembly?
    14. How many cycles are optimal?
    15. Which kit from NEB should I use for Golden Gate Assembly—the BsmBI-v2 kit (NEB #E1602) or the original BsaI-HFv2 kit (NEB #E1601)?
    16. Why is Golden Gate also used for single insert cloning?
    17. How can I access pGGAselect as a GenBank or FASTA file?
    18. Will EDTA interfere with downstream BsaI restriction and ligation?
    19. Why is there a 55°C, 5 min heat step at the end of the assembly reaction?

  • 实验技巧

    强烈推荐使用 NEB Golden Gate 组装工具（GoldenGate.neb.cn）；此工具可检查插入片段的内部是否有 IIS 型限制性内切酶位点，帮助设计引物扩增插入片段用于 Golden Gate 组装。设计的引物应在识别位点两侧的 5′ 端包含 6 个碱基、识别位点，以及有助于插入片段正确退火和连接的 4 碱基突出末端。所有突出末端将自动设计为非回文序列（以消除自插入连接）、唯一且方向正确，以确保正确组装。

     

    NEB 的不断研究加深了我们对连接酶保真性的认识，包括评价末端连接保真度的多种手段的开发，从而更好地预测何种突出末端具有更高连接保真度（Potapov V. et al. (2018) ACS Synth. Biol，7，2665–2674.）。连接酶保真度信息可与 NEB Golden Gate 组装试剂盒结合使用，实现高效且准确的复杂组装。更多详情请登陆 www.neb.cn/GoldenGate。

     

    vNEB 开发了连接酶保真性分析软件，以协助设计高保真 Golden Gate 组装：

    • Ligase Fidelity Viewer – 使突出末端连接偏好可视化
    • GetSet™ – 预测高保真连接位点组合
    • SplitSet™ – 将 DNA 拆分成易于高保真无缝组装的 DNA 序列

    更多详情请访问 neb.cn/research/NEBeta-tools 

     
    标准 Golden Gate 操作流程建议采用 30 个循环，酶切和连接交替进行。BsaI-HFv2、BsmBI-v2 和 T4 DNA 连接酶非常稳定，支持进行多达 60 个循环，仍保持高效率和高保真性。考虑是否可以通过增加更多循环数来优化实验流程。

ridge Golden Gate 组装试剂盒（BsmBI-v2） |NEB酶试剂 New England Biolabs

发表于由

上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

NEBridge Golden Gate 组装试剂盒（BsmBI-v2）内含优化的 BsmBI-v2 和 T4 DNA 连接酶预混液。BsmBI-v2 是 NEB 公司研发的 BsmBI 的升级版本，在 Golden Gate 组装中的表现优于原酶。利用 Golden Gate 方法，混合液可以完成多个插入片段/模块的组装，也可用于单插入片段克隆/文库构建。试剂盒还随附目的质粒 pGGAselect，为组装提供骨架。该多功能目的质粒上定向克隆有 BsmBI-、BsaI- 和 BbsI- 的识别位点，使其能方便地与这三种在 Golden Gate 中最常用的 IIS 型限制性内切酶一起使用。该质粒还含有多个限制性内切酶识别位点，方便进行亚克隆，并具有 T7/SP6 启动子序列，供体外转录使用。

Golden Gate 组装技术（1,2）起源于 1996 年，当时是第一次使用 IIS 型限制性内切酶和 T4 DNA 连接酶依次（3）或同时（4）将多个目的基因插入到同一个载体骨架上。

IIS 型限制性内切酶结合于识别位点，却在识别位点的下游特定位置进行切割，切割位点是位置特异的，而非序列特异的。这样，单个 IIS 型限制性内切酶可用于产生具有特定突出末端的 DNA 片段。例如，BsmBI 的识别位点为 CGTCTC(N1/N5)，其中 CGTCTC 是识别和结合位点，而 N1/N5 表示切割位点位于上链的第一个碱基后，下链的第五个碱基后。片段的连接是通过酶切产生的 4 个碱基突出端互补而形成。酶切后的片段及最终组装产物不再含有 IIS 型限制性内切酶识别位点，所以不可能进一步发生酶切。组装产物随时间逐渐积累。

该方法特别适用于多重组装实验，例如 TALEs（Transcription Activator Like Effectors，转录激活因子样效应物）（5），以及 TALENs（TALE 与 FokI 核酸酶催化结构域融合表达）（6）。Golden Gate 方法也适用于单个片段克隆、构建不同来源的文库克隆来自不同来源的片段和涉及定向进化的多位点突变研究（7）。

请注意，虽然 Golden Gate 组装中常用到 BsmBI 内切酶，但 NEB 的试剂盒和操作步骤中则使用 BsmBI-v2，该酶是原酶经过改造和优化的升级版。

观看此视频教程，了解更多 Golden Gate 组装工作流程。

图 1：概述：使用 BsmBI-v2 进行 Golden Gate 组装操作

ridge Golden Gate 组装试剂盒（BsmBI-v2） |

图 2：Golden Gate 工作流程

ridge Golden Gate 组装试剂盒（BsmBI-v2） |

简单来说，Golden Gate 组装需要 IIS 型内切酶识别位点，在本示例中，识别位点（CGTCTC）加在 dsDNA 片段双侧末端。酶切后，识别位点不再存在，每个片段产生 4 个碱基突出末端，用于引导组装。
图 3：用 BsmBI-v2 进行高效率和高保真 Golden Gate 组装

ridge Golden Gate 组装试剂盒（BsmBI-v2） |

遵循 11-20+ 片段组装的推荐循环步骤，在含有 LacI/LacZ 的表达框中组装 24 个片段。虽然 30 个循环足以完成复杂组装，但 BsmBI-v2 和 T4 DNA 连接酶的稳定性允许连续进行 65 个循环的组装且背景低。（a）组装效率和（b）组装准确性（保真度）与循环数的关系如图所示。
图 4：用 BsmBI-v2 和 T4 DNA 连接酶进行复杂组装

ridge Golden Gate 组装试剂盒（BsmBI-v2） |

遵循 11-20+ 片段组装的推荐的循环步骤，在含有 LacI/LacZ 的表达框中组装 24 个片段，但延长循环数增加到 65 个循环。从 25 µl 组装反应液中取 2 µl 进行转化，取 1/10 体积的复苏菌液涂布到平板上，共得到 1,100 个菌落，菌落保真度高达 96%，相当于每次组装反应中得到 137,500 个菌落。该实验证明了酶混合液的稳定性，如果预期获得最大组装效率，循环数量可以超过标准的 30 个循环。
图 5：

ridge Golden Gate 组装试剂盒（BsmBI-v2） |

pGGAselect 是一个大小为 2,220 bp 的克隆载体，可用于 Golden Gate 组装。该质粒含有两个 BsmBI 位点；用 BsmBI 酶切会释放 65 bp 的片段和 2,155 bp 的载体骨架片段，以接收插入片段或组装片段。
产品类别:
DNA Assembly, Cloning and Mutagenesis Kits Products

应用:
DNA Assembly and Cloning,
High-throughput cloning and automation solutions,
NEBridge® Golden Gate Assembly

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E1602S     -20    
        NEBridge® Golden Gate Enzyme Mix (BsmBI-v2) M2617AVIAL -20 1 x 0.02 ml Not Applicable
        T4 DNA Ligase Reaction Buffer B0202SVIAL -20 1 x 1 ml 10 X
        pGGAselect DNA N0309AAVIAL -20 1 x 0.1 ml 75 ng/µl
    • E1602L     -20    
        NEBridge® Golden Gate Enzyme Mix (BsmBI-v2) M2617AAVIAL -20 1 x 0.1 ml Not Applicable
        T4 DNA Ligase Reaction Buffer B0202SVIAL -20 1 x 1 ml 10 X
        pGGAselect DNA N0309AAVIAL -20 1 x 0.1 ml 75 ng/µl

  • 特性和用法

    需要但不提供的材料

    • 用户自备的插入片段
    • 感受态细胞
    • 其它转化试剂

  • 优势和特性

    Features

    • 无缝克隆 – 组装后无额外碱基存在
    • 单次反应即可按顺序组装多个片段
    • 也可用于单个片段克隆
    • 有效组装高 GC 区和重复区
    • 兼容片段长度广（< 100 bp to > 15 kb）
    • 登陆 GoldenGate.neb.cn 使用免费的在线工具
    • 2 年保质期

  • 相关产品

    相关产品

    • Quick-Load® 紫色 1 Kb Plus DNA Ladder
    • Q5® 热启动超保真 2X 预混液
    • Q5® 热启动超保真 DNA 聚合酶
    • dNTP 混合液
    • Q5® 定点突变试剂盒
    • Q5® 定点突变试剂盒（不含感受态细胞）
    • NEB® 10-beta E. coli 感受态细胞（高效级）
    • NEB® 5-alpha E. coli 感受态细胞（高效级）
    • NEB® Stable E. coli 感受态细胞（高效级）
    • NEB® 10-beta E. coli 电转感受态细胞
    • T7 表达 E. coli 感受态细胞（高效级）
    • Nuclease-free Water
    • NEB® Turbo E. coli 感受态细胞（高效级）

  • 参考文献

    1. Engler, C. et al. (2008). PLoS ONE. 3, e3647.
    2. Engler, C. et al. (2009). PLoS ONE. 4, e5553.
    3. Lee, J.H. et al. (1996). Genetic Analysis: Biomolecular Engineering. 13, 139–145.
    4. Padgett, K.A. and Sorge, J.A. (1996). Gene. 168, 31–35.
    5. Weber, E. et al. (2011). PLoS ONE. 6 , e19722.
    6. Christian, M. et al. (2010). Genetics. 186, 757–761.
    7. Pullman, P. et al. (2019). Nature. 9, 10932.
    8. Potapov, V. et al. (2018). ACS Synth. Biol. 7, 2665–2674.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Golden Gate Assembly Protocol for using NEBridge® Golden Gate Assembly Kit (BsmBI-v2) (NEB #E1602)
    2. Transformation Protocol for NEBridge® Golden Gate Assembly Kit (BsmBI-v2) (NEB #E1602)
    3. Recommended Screening Protocols for NEBridge® Golden Gate Assembly Kit (BsmBI-v2) (NEB #E1602)
    4. 35-Fragment Golden Gate Assembly using BsmBI-v2 (NEB #E1602)

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE1602

  • 使用指南

    • Expanded “assembly standards” for MoClo, GoldenBraid2.0 and other modular Golden Gate Assembly methods
    • Insert Considerations for NEBridge® Golden Gate Assembly Kit (BsmBI-v2) (NEB #E1602)
    • Technical Tips For Optimizing Golden Gate Assembly Reactions

  • 应用实例

    • Breaking through the Limitations of Golden Gate Assembly
    • Accelerating DNA Construction to Protein Expression: A Rapid 1-Day Workflow Using NEBridge® Golden Gate Assembly 

工具 & 资源

  • 选择指南

    • Synthetic Biology/DNA Assembly Selection Chart
    • Type IIS Restriction Enzymes

  • Web 工具

    • DNA Sequences and Maps Tool
    • NEBridge® Golden Gate Assembly Tool
    • NEBridge® Ligase Fidelity Tools

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. What is the mechanism for Golden Gate Assembly?
    2. Which kit from NEB should I use for Golden Gate Assembly—the BsmBI-v2 kit (NEB #E1602) or the original BsaI-HFv2 kit (NEB #E1601)?
    3. What if there are internal BsaI and BsmBI sites in my insert sequences?
    4. The Type IIS restriction enzyme used in this kit is BsmBI-v2. How does it compare to the original BsmBI or Esp3I?
    5. How does the performance of this kit compare to “home brews” built with individual Type IIS restriction enzymes and T4 DNA Ligase components?
    6. What affects the efficiency of Golden Gate Assembly?
    7. Why do many of the published Golden Gate Assembly articles feature precloned inserts as opposed to inserts generated by PCR?
    8. Using purified amplicons directly without precloning seems much easier, but is the assembly efficiency decreased?
    9. Can PCR amplicons be used directly in assembly reactions without purification?
    10. Why is Golden Gate also used for single insert cloning?
    11. Why do assembly reactions end with a 5 minute, 60°C incubation step?
    12. How can I minimize PCR-generated errors in my amplicon inserts?
    13. What is an appropriate negative control for Golden Gate Assembly?
    14. How many cycles are optimal?
    15. Can I use other competent E. coli strains than NEB 10-beta? Can I use subcloning efficiency cells?
    16. How can I access pGGAselect as a GenBank or FASTA file?

  • 实验技巧

    强烈推荐使用 NEB Golden Gate 组装工具（GoldenGate.neb.cn）；此工具可检查插入片段的内部是否有 IIS 型限制性内切酶位点，帮助设计引物扩增插入片段用于 Golden Gate 组装。设计的引物应在识别位点两侧的 5′ 端包含 6 个碱基、识别位点，以及有助于插入片段正确退火和连接的 4 碱基突出末端。所有突出末端将自动设计为非回文序列（以消除自插入连接）、唯一且方向正确，以确保正确组装。

     

    NEB 的不断研究加深了我们对连接酶保真性的认识，包括评价末端连接保真度的多种手段的开发，从而更好地预测何种突出末端具有更高连接保真度（Potapov V. et al. (2018)ACS Synth. Biol，7，2665–2674.）。连接酶保真度信息可与 NEB Golden Gate 组装试剂盒结合使用，实现高效且准确的复杂组装。如需了解更多信息，请登陆 www.neb.cn/GoldenGate。

     

    NEB 开发了连接酶保真性分析软件，以协助设计高保真 Golden Gate 组装：

    • Ligase Fidelity Viewer – 使突出末端连接偏好可视化
    • GetSet™ – 预测高保真连接位点组合
    • SplitSet™ – 将 DNA 拆分成易于高保真无缝组装的 DNA 序列

    使用这些软件请登陆 neb.cn/research/NEBeta-tools

     

    标准 Golden Gate 操作流程建议采用 30 个循环，酶切和连接交替进行。BsaI-HFv2、BsmBI-v2 和 T4 DNA 连接酶非常稳定，支持进行多达 60 个循环，仍保持高效率和高保真性。考虑是否可以通过增加更多循环数来优化实验流程。