产品信息

Cre 重组酶是来自噬菌体 P1 的 I 型拓扑异构酶，可催化 loxP 位点间 DNA 进行位点特异性重组（1）。该酶不需要能量辅因子，Cre 介导的重组可迅速在底物和反应产物之间达到平衡（2）。loxP 识别元件是一段 34 bp 的序列，包括两个 13 bp 的反向重复序列和中间的 8 bp 间隔区域，该间隔区域赋予了它的定向性（3）。重组产物取决于 loxP 位点的位置和相对方向。两个含有单 loxP 位点的 DNA 将被融合。两个正向重复 loxP 位点间的 DNA 将以环状形式切除，而两个反向 loxP 位点间的 DNA 序列将被翻转。

图 1：

产品来源

纯化自重组大肠杆菌菌株，该菌株携带有编码噬菌体 P1 的 Cre 重组酶的质粒，酶的 N 端添加了丙氨酸和甘氨酸残基（4）。

产品类别:

Recombinases Products

• 产品组分信息

  本产品提供以下试剂或组分：

  NEB #	名称	组分货号	储存温度	数量	浓度
  M0298S     -20       Cre Recombinase M0298SVIAL -20 1 x 0.05 ml 1,000 units/ml   Cre Recombinase Reaction Buffer B0298SVIAL -20 1 x 1.5 ml 10 X   Control DNA Linearized pLox2+ N0416SVIAL -20 1 x 0.016 ml 0.125 mg/ml
  M0298L     -20       Cre Recombinase M0298LVIAL -20 1 x 0.25 ml 1,000 units/ml   Cre Recombinase Reaction Buffer B0298SVIAL -20 1 x 1.5 ml 10 X   Control DNA Linearized pLox2+ N0416SVIAL -20 1 x 0.016 ml 0.125 mg/ml
  M0298M     -20       Cre Recombinase M0298MVIAL -20 1 x 0.017 ml 15,000 units/ml   Cre Recombinase Reaction Buffer B0298SVIAL -20 1 x 1.5 ml 10 X   Control DNA Linearized pLox2+ N0416SVIAL -20 1 x 0.016 ml 0.125 mg/ml

• 特性和用法

  单位定义

  1 单位指在 37℃ 条件下，当总反应体积为 50 μl 时，30 分钟能使 0.25 μg 的 pLox2+ 对照 DNA 产生最大位点特异性重组所需的酶量。可以通过琼脂糖凝胶电泳以及反应物转化后在氨苄青霉素抗性平板筛选来确定最大重组效果。

  反应条件

  1X Cre 重组酶反应缓冲液
  Incubate at 37°C

  1X Cre 重组酶反应缓冲液
  33 mM NaCl
  50 mM Tris-HCl
  10 mM MgCl₂
  (pH 7.5 @ 25°C)

  使用浓度

  1,000 – 15,000 units/ml

  贮存溶液

  15 mM Tris-HCl
  250 mM NaCl
  0.3 mg/ml BSA
  50% Glycerol
  pH 8 @ 25°C

  热失活

  70°C for 10 minutes

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• 注意事项

  1. 建议进行琼脂糖凝胶电泳前，将 Cre 重组酶反应混合物于 70℃ 温育 10 分钟。
  2. 由于 Cre 重组酶反应是一个平衡反应，用 loxP2+ 对照底物仅有 20-30% 发生重组（图 1）。由于重组产物的量较少，故溴化乙锭染色后呈现微弱条带，同时伴有底物染色强度相应减弱。
  3. 延长温育时间不会提高重组效率，反而可能导致高分子量重组产物的生成。
  4. 增加反应中 Cre 重组酶的用量将形成 loxP 依赖型 Cre-DNA 聚集体，从而抑制重组反应。
  5. 对照 DNA：线性化的 pLox2+ 长度为 3,625 bp，loxP 位点距末端约 400 bp。两个 loxP 位点之间有复制起点和氨苄青霉素抗性基因。loxP 位点之间的重组产生了一个含氨苄青霉素抗性的环状质粒（2,787 bp，该质粒在 0.8% 的琼脂糖凝胶上的迁移率大约与 1.7 kb 的片段相同），以及一个 838 bp 的 DNA 片段。

• 参考文献

  1. Abremski, K. and Hoess, R. (1984). J. Biol. Chem.. 259,
  2. Abremski, K. et al. (1983). Cell. 32, 1301-1311.
  3. Metzger, D. and Feil, R (1999). Curr. Opin. Biotechnol.. 10,
  4. Cantor, E. and Chong, S. (2001). Protein Expr. Purif.. 22,

操作说明、说明书 & 用法

• 操作说明

  1. Protocol for Cre Recombinase (M0298)

FAQs & 问题解决指南

• FAQs

  1. What is the molecular weight of Cre Recombinase?
  2. Can Cre Recombinase be used to linearize a BAC containing a loxP site?
  3. What is the sequence of the loxP sites in the pLox2+ control DNA to be used with Cre Recombinase?
  4. Why aren’t the product bands from my Cre Recombinase reaction mix sharp when run on an agarose gel?
  5. Can Cre Recombinase be used to move an insert between expression vectors?