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5´ AppDNA/RNA 热稳定连接酶 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

5´ AppDNA/RNA 热稳定连接酶是通过对来自嗜热自养甲烷杆菌（Methanobacterium thermoautotrophicum）（1）的 RNA 连接酶催化位点上的赖氨酸进行点突变得到的酶。该酶发挥作用不依赖 ATP，但需要 5´ 预腺苷化的接头连接到 RNA 或单链 DNA 的 3´-OH 末端。该酶也可催化 3´ 端发生 2´-O-甲基化的 RNA 和 5´ 腺苷化接头（1）的连接反应。连接反应的最佳温度范围为 60 – 65℃（2）。突变体连接酶无法使 RNA 或单链 DNA 的 5´-磷酸发生腺苷化，因此能减少不需要的连接产物（串联和环化）的形成。

该连接酶可在 65℃ 条件下反应，能减少 RNA 连接实验中 RNA 二级结构的限制。

产品来源

5´ AppDNA/RNA 热稳定连接酶是一种 His 标签融合蛋白，在大肠杆菌中表达得到。

产品类别:
RNA Ligation,
DNA Ligases Products

应用:
Non-Cloning Ligation

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0319S     -20    
        Thermostable 5´ App DNA/RNA Ligase M0319SVIAL -20 1 x 0.02 ml 20 µM
        NEBuffer™ 1 B7001SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X
        MnCl2 B0787AVIAL -20 1 x 0.5 ml 50 mM
    • M0319L     -20    
        Thermostable 5´ App DNA/RNA Ligase M0319LVIAL -20 1 x 0.1 ml 20 µM
        NEBuffer™ 1 B7001SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X
        MnCl2 B0787AVIAL -20 1 x 0.5 ml 50 mM

  • 特性和用法

    反应条件

    1X NEBuffer™ 1
    Incubate at 65°C

    1X NEBuffer™ 1
    10 mM Bis-Tris-Propane-HCl
    10 mM MgCl2
    1 mM DTT
    (pH 7 @ 25°C)

    贮存溶液

    50 mM KCl
    10 mM Tris-HCl
    0.1 mM EDTA
    1 mM DTT
    50% Glycerol
    pH 7.5 @ 25°C

    热失活

    否

  • 优势和特性

    应用特性

    • 将 5´ 预腺苷化且 3´-封闭的 DNA 接头连接到 RNA 和单链 DNA 的 3´-OH。

  • 注意事项

    1. 为了在单链 DNA 与腺苷化的 DNA 接头之间实现最佳连接，推荐使用添加了锰的 NEBuffer 1。若要将单链 RNA 与腺苷化的 DNA 接头连接，使用 NEBuffer 1 即可。
    2. DNA 与 AppDNA 的连接效率会降低，因此我们建议延长温育时间至过夜。
    3. 我们建议使用热循环仪或顶部加热来减少蒸发。
    4. 为了对酶进行灭活，我们推荐使用蛋白酶 K 处理或在 90℃ 下加热灭活 3 分钟
    5. 推荐使用蛋白酶 K 处理来释放与连接酶结合的 RNA；否则凝胶上可能出现弥散现象。

  • 参考文献

    1. Zhelkovsky, A. M., McReynolds, L. A. (2012). BMC Mol. Biol.. 13, 24.
    2. Torchia, C., Takagi, Y. and Ho, C. K. (2008). Nucleic Acids Res.. 36, 6218-6227.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Protocol for ssDNA/RNA Ligation (NEB #M0319)
    2. Protocol for one-step adenylation and ligation of 5´p DNA and 3’OH RNA using Mth RNA Ligase (NEB #M2611) and Thermostable 5’ App DNA/RNA Ligase (NEB #M0319)

工具 & 资源

  • 选择指南

    • Properties of DNA and RNA Ligases
    • RNA Ligase Selection Chart
    • Substrate-based Ligase Selection Chart

  • Web 工具

    • NEBcloner®
    • NEBioCalculator®

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. How can you synthesize an adenylated DNA linker?
    2. Can I use the wild type Mth RNA ligase included in the 5’ DNA adenylation kit instead of the Thermostable 5’AppDNA/RNA ligase for library construction?
    3. How much Thermostable 5’AppDNA/RNA ligase do I need to add to a reaction?
    4. Why do you recommend adding MnCl2 to the DNA ligation but not the RNA reaction?
    5. Does the Thermostable 5’ AppDNA/RNA ligase ligate dsRNA or dsDNA?
    6. Will PEG or increased time enhance the amount of ligated product?
    7. Why is the RNA running as a smear or stuck in the well?

  • 实验技巧

    应该使用哪种连接酶？