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Next® Q5U® 预混液 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

NEBNext Q5U 预混液针对含尿嘧啶的 NGS 文库的超保真扩增进行了优化。这种热启动试剂可读取尿嘧啶，实现稳定、超保真和均一的文库扩增。
该预混液中的扩增酶 Q5U，是 Q5 超保真 DNA 聚合酶的优化版本，是新型的热稳定 DNA 聚合酶，具有 3´→5´ 核酸外切酶活性，并且融合有 so7d 结构域，提高了持续扩增能力。NEBNext Q5U 预混液是一种基于适体的热启动剂型，方便在室温下建立反应体系。方便的 2X 预混液形式包含 dNTPs、Mg++ 和专利缓冲液，仅需加入引物和 DNA 模板即可进行高效扩增。

NEBNext Q5U 预混液包含在 NEBNext 酶学转化法甲基化建库试剂盒（NEB #E7120）中，并且还适用于重亚硫酸盐测序实验流程中的文库扩增。

产品类别:
Epigenetic Analysis Products,
Q5® High-Fidelity DNA Polymerases Products,
Epigenetics Products,

PCR, qPCR & Amplification Technologies Products

应用:
Polymerases for NGS Library Preparation,
DNA Methylation Analysis,
Bisulfite Conversion,

Epigenetics,

Specialty PCR

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0597S     -20    
        NEBNext® Q5U® Master Mix M0597SVIAL -20 1 x 1.25 ml 2 X
    • M0597L     -20    
        NEBNext® Q5U® Master Mix M0597SVIAL -20 5 x 1.25 ml 2 X

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Reaction Setup NEBNext® Q5U® Master Mix (NEB #M0597)

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Can NEBNext Q5U Master Mix be used to amplify templates containing uracils?
    2. Is the NEBNext Q5U Master Mix a hot start formulation?
    3. What cycling conditions should I use for the NEBNext Q5U Master Mix?
    4. How many cycles of PCR should I perform with the NEBNext Q5U Master Mix?
    5. Are the DNA products produced by the NEBNext Q5U Master Mix blunt-ended or do they have a single base 3´ overhang?
    6. Will NEBNext Ultra II Q5 Master Mix incorporate dUTPs?

Gibson 组装® 预混液 |NEB酶试剂 New England Biolabs

发表于由

上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

Gibson 组装® 预混液 |   

Gibson 组装法由 J. Craig Venter 研究所的 Daniel Gibson 博士及其同事发明，由 Synthetic Genomics 公司授权予 NEB 许可。不管片段的长短和末端匹配性如何，该方法都可以成功组装多个 DNA 片段。对于较大的 DNA 构建体而言，该方法易用、灵活、适用性强，因此已被合成生物学领域广泛采用。

Gibson 组装可在等温条件下，单管反应实现多个带重叠末端的 DNA 片段的组装（1,2）。Gibson 组装预混液在同一反应缓冲液中有三种不同的酶活性：

  • 核酸外切酶活性会产生单链 3´ 突出末端，促使互补的末端重复序列（重叠区）退火。
  • 聚合酶活性会填补退火片段的缺口。
  • DNA 连接酶活性能在组装后的 DNA 切刻处进行连接。

最终形成双链闭合的 DNA 分子，可作为 PCR、RCA 的模板或其它分子生物学应用，包括直接转化。Gibson 的团队和其他研究者们已成功使用该方法组装寡核苷酸、具有多个重叠的 DNA（15–80 bp）以及数百 kb 长的片段（1–2）。

为帮助您选择最佳 DNA 组装方法，请参考合成生物学/DNA 组装选择指南。

如需帮助设计引物，请观看引物设计视频。

Gibson 组装法概述

Gibson 组装® 预混液 |

规格：

10 μl 2X Gibson 组装预混液和 6 个片段（5 个片段为 400 bp，1 个片段为 2,780 bp，重叠为 40 bp，每个 0.05 pmol），在 20 μl 反应体系，50℃ 温育 60 分钟。根据转化操作流程，取 2 μl 预混液/片段混合物转化 NEB 5-alpha E. coli 感受态细胞（NEB #C2987）。在含 IPTG/Xgal 的氨苄青霉素抗性平板上涂布 1/10 的复苏菌液并温育过夜，能观测到 100 个以上白色菌落。

Gibson 组装预混液操作流程概述：

  • 设计引物以扩增具有适当重叠的片段（和/或载体）
  • 使用超保真 DNA 聚合酶 PCR 扩增片段。
  • 使用超保真 DNA 聚合酶通过 PCR 扩增或利用限制性内切酶消化来制备线性化的载体。
  • 用琼脂糖凝胶电泳、Nanodrop™ 仪器或其它方法来确定片段浓度
  • 将 DNA 添加到 Gibson 组装预混液中，并在 50℃ 温育 15 分钟至 1 小时（时长视组装的片段数量而定）。
  • 转化到 E. coli 感受态细胞或直接在其它应用中使用
产品类别:
DNA Assembly, Cloning and Mutagenesis Kits Products

应用:
Gibson Assembly®

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E2611S     -20    
        NEBuilder® Positive Control N2611AVIAL -20 1 x 0.05 ml Not Applicable
        Gibson Assembly Master Mix M5510AVIAL -20 1 x 0.1 ml 2 X
    • E2611L     -20    
        NEBuilder® Positive Control N2611AVIAL -20 1 x 0.05 ml Not Applicable
        Gibson Assembly Master Mix M5510AAVIAL -20 1 x 0.5 ml 2 X

  • 特性和用法

    需要但不提供的材料

    DNA 聚合酶（用于制备 PCR 产物）：
    建议使用 Q5® 超保真 DNA 聚合酶（NEB #M0491）或相关产品，例如 Q5 热启动 Flex DNA 聚合酶（NEB #M0493）、Q5 热启动 Flex 2X 预混液（NEB #M0494）。

    添加了适合的抗生素的 LB（Luria-Bertani）平板。

    SOC Outgrowth 培养基（NEB #B9020）。

    感受态细胞：
    建议使用 NEB 5-alpha E. coli 感受态细胞（高效级，NEB #C2987）。如果是大于 10 kb 的组装产物，NEB 建议使用 NEB 10-beta E. coli 感受态细胞（高效级，NEB #C3019）或 NEB 10-beta E. coli 电转感受态细胞（NEB #C3020）。

    存储注意事项

    • Store at -20°C. Thaw, vortex thoroughly before use and keep on ice.

  • 优势和特性

    Features

    • 增加组装产物的成功率，尤其是组装较大或数量较多的片段
    • 灵活的序列设计（无缝克隆）
    • 无需纯化步骤
    • 一小时内即可完成复杂组装
    • 可立即将 DNA 用于转化，或将 DNA 作为 PCR 或 RCA 的模板
    • 适用性强，适用于各种 DNA 改造，包括定点突变、插入和缺失

  • 相关产品

    相关产品

    • NEB® 10-beta E. coli 感受态细胞（高效级）
    • NEB® 10-beta E. coli 电转感受态细胞
    • NEB® 5-alpha E. coli 感受态细胞（高效级）
    • SOC Outgrowth 培养基
    • Gibson 组装® 克隆试剂盒
    • Q5® 热启动超保真 2X 预混液
    • Q5® 热启动超保真 DNA 聚合酶
    • Q5® 超保真 2X 预混液
    • Q5® 超保真 DNA 聚合酶
    • t1010-monarch-plasmid-miniprep-kit
    • Monarch® DNA 胶回收试剂盒
    • Monarch® PCR & DNA 纯化试剂盒（5 μg）

  • 注意事项

    1. 一般说明：
      强烈建议使用我们的在线工具 NEBuilder™ 来设计 PCR 引物，使其在相邻 DNA 片段之间具有重叠序列，以将其组装到克隆载体。
    2. 使用说明：

      为确保成功组装以及后续成功转化组装的 DNA，NEB 建议遵循以下做法：

      • 细胞：感受态细胞的转化效率可能相差几个数量级。观察到的组装效率与用于转化的感受态细胞效率直接相关。
      • 电转化：电转化可以将转化效率提高几个数量级。将 Gibson 组装预混液产品用于电转化时，需要将反应液稀释 3 倍，并取 1 μl 用于转化。
      • DNA：如果 Gibson 组装反应液中所有 PCR 产物的总体积不超过 Gibson 组装反应体积的 20%，无需进行 PCR 产物纯化。PCR 产物体积过多会引入更多 PCR 产物中存在的 PCR 反应缓冲液和未使用的引物，从而降低 Gibson 组装和转化的效率。PCR 产物柱纯化可能会使 Gibson 组装和转化的效率增加 2 – 10 倍，在组装三个或更多 PCR 片段时，或组装长度超过 5 kb 的片段时，强烈建议进行 PCR 产物柱纯化。用于组装的纯化 DNA 可溶于 ddH2O（推荐使用 Milli-Q® 水或同等纯度的水）、TE 或其它稀释缓冲液。
      • 插入片段：直接将片段组装到克隆载体中时，组装片段的浓度应比载体浓度高至少 2–3 倍。组装三个或更多片段时，建议使用等摩尔比的片段。
      • 生物学特性：一些 DNA 结构，包括反向重复序列和串联重复序列，会被大肠杆菌选择性丢失。大肠杆菌无法耐受某些重组蛋白，因此可能会导致转化效率较低或菌落较小。

  • 参考文献

    1. Gibson, D.G. et.al (2009). NatureMethods. 343-345.
    2. Gibson, D.G. et al. (2010). NatureMethods. 901-903.
    3. Barnes, W.M. (1994). Proc. Natl. Acad. Sci.. 91, 2216-2220.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Gibson Assembly® Master Mix – Assembly (E2611)
    2. Gibson Assembly® Chemical Transformation Protocol (E2611)
    3. Gibson Assembly® Electrocompetent Cells Transformation Protocol (E2611)

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE2611_E5510

  • 应用实例

    • Improved methods for site-directed mutagenesis using Gibson Assembly® Master Mix

工具 & 资源

  • 选择指南

    • Synthetic Biology/DNA Assembly Selection Chart

  • Web 工具

    • NEBuilder® Assembly Tool

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. I am not sure whether to choose NEBuilder HiFi DNA Assembly or NEB Gibson Assembly? How are the products different?
    2. What are the advantages of this method compared to traditional cloning methods?
    3. How large a DNA fragment can I assemble?
    4. How many fragments of DNA can be assembled in one reaction?
    5. What are the shortest overlaps that can be used with this assembly method?
    6. What are the longest overlaps that can be used with this method?
    7. Can ≤ 200 bp dsDNA fragments be assembled by this method?
    8. Can ssDNA oligonucleotides be combined and assembled with dsDNA fragments?
    9. Can longer or shorter incubation times be used?
    10. Will the reaction work at other temperatures?
    11. Is it necessary to inactivate restriction enzymes after vector digestion?
    12. I would like to produce overlapping dsDNA fragments by PCR. Do I need to use PCR primers that have been purified by PAGE or HPLC?
    13. I would like to assemble ssDNA oligonucleotides into dsDNA fragments. Do I need to use oligonucleotides that have been purified by PAGE or HPLC?
    14. Can I use a 15-nt overlap that is entirely composed of His-tag repeats (i.e. CACCACCACCACCAC)?
    15. Can you PCR-amplify the assembled product?
    16. What should I do if my assembly reaction yields no colonies, a small number of colonies, or clones with the incorrect insert size following transformation into E. coli?
    17. How can I reduce the number of vector-only background colonies?
    18. What type of competent cells are suitable for transformation of DNA constructs created using Gibson Assembly?
    19. Can I use electroporation instead of chemical transformation?
    20. Are there any differences between the Gibson Assembly Master Mix (NEB #E2611) and Gibson Assembly Master Mix included in the Gibson Assembly Cloning Kit (NEB #E5510)?
    21. Are there any differences between the requirements for 2-3 fragmentassemblies versus 4–6?
    22. The Gibson Assembly Master Mix control reaction is not giving me any colonies. Why?
    23. When using a polymerase that doesn’t contain a 3′-5′ exonuclease activity (such as Taq DNA Polymerase) to amplify fragments to be used in a Gibson Assembly reaction, should I be concerned about the potential 3′ mismatch generated by the addition of a non-templated nucleotide?
    24. Is storing Gibson Assembly Master Mix at -80°C harmful?
    25. I would like to use NEBuilder but am concerned about user data privacy. How does NEB handle the information that I enter into NEBuilder?
    26. Can I Use other primer design tools such as SnapGene for Gibson Assembly, to design primers for NEBuilder HiFi DNA Assembly?
    27. What antibiotic resistance is encoded in the NEBuilder Positive Control (assembly control)?

Golden Gate 组装预混液 |NEB酶试剂 New England Biolabs

发表于由

上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

NEB Golden Gate 组装预混液是 BsaI 和 T4 DNA 连接酶的优化预混液。这些酶与全面优化的缓冲液结合起来使用，可通过 Golden Gate 方法进行多个插入片段/模块的组装。试剂盒还随附目的质粒 pGGA，为组装提供骨架，同时为亚克隆提供限制性内切酶酶切位点，以及为体外转录提供 T7/SP6 启动子序列。

Golden Gate 组装技术（1,2）起源于 1996 年，当时是第一次使用 IIS 型限制性内切酶和 T4 DNA 连接酶依次（3）或同时（4）将多个目的基因插入到同一个载体骨架上。

IIS 型限制性内切酶结合于识别位点，却在识别位点的下游特定位置进行切割，切割位点是位置特异的，而非序列特异的。这样，单个 IIS 型限制性内切酶可用于产生具有特定突出末端的 DNA 片段。例如，BsaI 的识别位点为 GGTCTC（N1/N5），其中 GGTCTC 是识别和结合位点，而 N1/N5 表示切割位点位于上链的第一个碱基后，下链的第五个碱基后。片段的连接是通过酶切产生的 4 个碱基突出端互补而形成。酶切后的片段及最终组装产物不再含有 IIS 型限制性内切酶识别位点，所以不可能进一步发生酶切。 组装产物随时间逐渐积累。

Golden Gate 方法特别适用于多重组装实验，例如 TALEs（Transcription Activator Like Effectors，转录激活因子样效应物）（5），以及 TALENs（TALE 与 FokI 核酸酶催化结构域融合表达）（6）。此方法也可用于克隆单插入片段。观看此视频教程，了解更多 Golden Gate 组装工作流程。

为帮助您选择最佳 DNA 组装方法，请参考合成生物学/DNA 组装选择指南。

图 1：概述：Golden Gate 组装的操作流程
Golden Gate 组装预混液 |
Golden Gate 组装预混液 |
图 2：Golden Gate 工作流程 Golden Gate 组装预混液 |
简单来说，Golden Gate 组装需要 IIS 型内切酶识别位点，在本示例中，BsaI 识别序列（GGTCTC）加在 dsDNA 片段双侧末端。酶切后，识别位点不再存在，每个片段产生 4 个碱基突出末端，用于引导组装。
图 3：NEB Golden Gate 组装预混液可实现优质组装Golden Gate 组装预混液 |
组装反应体系直接使用预克隆的插入片段或 PCR 扩增子。反应条件根据如上所示的厂商说明书建立。每种反应类型均进行了两次独立的实验。
Golden Gate 组装预混液 |
上图展示了 pGGA 质粒的特性，包括组装后被切除和替代的表达框。唯一的限制性酶切位点用黑色字表示。扩展框标明了用于测序或菌落 PCR 分析引物的位置、启动子区域、附加限制性酶切位点、载体骨架经 BsaI 酶切后产生的四碱基突出端以及表达框的序列。
产品类别:
DNA Assembly, Cloning and Mutagenesis Kits Products

应用:
DNA Assembly and Cloning,
High-throughput cloning and automation solutions,
NEBridge® Golden Gate Assembly

  • 特性和用法

    需要但不提供的材料

    • 用户自备的插入片段
    • 感受态细胞
    • 其它转化试剂

  • 优势和特性

    Features

    • 无缝克隆 – 组装后无额外碱基存在
    • 单次反应即可按顺序组装多个片段
    • 也可用于单个片段克隆
    • 有效组装高 GC 区和重复区
    • 兼容片段长度广（< 100 bp to > 15 kb）
    • 登陆 GoldenGate.neb.cn 使用免费的在线工具

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    • Quick-Load® 紫色 1 Kb Plus DNA Ladder
    • Q5® 热启动超保真 2X 预混液
    • Q5® 热启动超保真 DNA 聚合酶
    • dNTP 混合液
    • Q5® 定点突变试剂盒
    • Q5® 定点突变试剂盒（不含感受态细胞）
    • NEB® 10-beta E. coli 感受态细胞（高效级）
    • NEB® 5-alpha E. coli 感受态细胞（高效级）
    • NEB® Turbo E. coli 感受态细胞（高效级）
    • NEB® Stable E. coli 感受态细胞（高效级）
    • NEB® 10-beta E. coli 电转感受态细胞
    • t1010-monarch-plasmid-miniprep-kit
    • Monarch® DNA 胶回收试剂盒
    • Monarch® PCR & DNA 纯化试剂盒（5 μg）
    • NEB® PCR 克隆试剂盒
    • NEB®  PCR 克隆试剂盒（不含感受态细胞）
    • T7 表达 E. coli 感受态细胞（高效级）

  • 参考文献

    1. Engler, C. et al (2008). PLoS ONE. 3: e3647.,
    2. Engler, C. et al (2009). PLoS ONE. 4: e5553.,
    3. Lee, J.H. et al (1996). Genetic Analysis: Biomolecular Engineering. 13; 139-145,
    4. Padgett, K.A. and Sorge, J.A. (1996). Gene. 168, 31-35.
    5. Weber, E. et al (2001). PLoS ONE. 6; e19722,
    6. Christian, M. et al (2010). Genetics. 186, 757-761.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Golden Gate Assembly Protocol for Using NEB Golden Gate Assembly Mix (E1600)
    2. Transformation Protocol for Using NEB Golden Gate Assembly Mix (E1600)
    3. Recommended Screening Protocols for Using NEB Golden Gate Assembly Mix (E1600)
    4. Golden Gate (24 Fragment) Assembly Protocol
    5. Golden Gate Assembly Protocol for Using NEBridge® Golden Gate Assembly Kit (BsaI-HF®v2) (E1601)
    6. Transformation Protocol for Using NEBridge® Golden Gate Assembly Kit (BsaI-HF®v2) (E1601)
    7. Recommended Screening Protocols for Using NEBridge® Golden Gate Assembly Kit (BsaI-HF®v2)

  • 应用实例

    • Breaking through the Limitations of Golden Gate Assembly

工具 & 资源

  • 选择指南

    • Synthetic Biology/DNA Assembly Selection Chart

  • Web 工具

    • NEBridge® Golden Gate Assembly Tool

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. What is the mechanism for Golden Gate Assembly?
    2. What affects the efficiency of Golden Gate Assembly?
    3. Can PCR amplicons be used directly in assembly reactions without purification?
    4. Why do many of the published Golden Gate Assembly articles feature precloned inserts as opposed to inserts generated by PCR?
    5. Using purified amplicons directly without precloning seems much easier, but is the assembly efficiency decreased?
    6. Will EDTA interfere with downstream BsaI restriction and ligation?
    7. Why is there a 55°C, 5 min heat step at the end of the assembly reaction?
    8. How can I minimize PCR-generated errors in my amplicon inserts?
    9. Can I use other competent E. coli strains than NEB 10-beta? Can I use subcloning efficiency cells?
    10. Why is Golden Gate also used for single insert cloning?
    11. Can the Golden Gate Assembly reactions be scaled down?
    12. I would like to use colony PCR to screen my transformants and sequence myassembly. Are there any recommended sequencing or colony PCR primers?
    13. I’m doing a moderate (4–5 insert) assembly but don’t have access to a thermal cycler. Can I use the simpler protocol using the 1 hr 37°C incubation?
    14. For amplicon inserts, why are the calculations suggested as using the overallpGGA destination plasmid length and the overall amplicon lengths? Shouldn’tonly the part of pGGA functioning as the vector backbone be used?

  • 实验技巧

    • 强烈推荐使用 NEB Golden Gate 组装工具（GoldenGate.neb.cn）；此工具可检查插入序列内部是否有 BsaI 位点，帮助设计引物扩增插入片段用于 Golden Gate 组装。设计的引物应在 BsaI 识别位点两侧的 5´ 端包含 7 个碱基、识别位点，以及有助于插入片段正确退火和连接的特定 4 碱基突出末端。所有突出末端将自动设计为非回文序列（以消除自插入连接）、唯一且方向正确，以确保正确组装。
    • 目前有两种基本的组装方案：37℃ 恒温温育，或在 37℃（既是保持连接酶稳定的温度范围，又是内切酶酶切的最佳温度）和 16℃（最佳连接温度）之间交替循环。组装方案选择建议以组装反应体系中的插入片段数量为准，但仍具有很大的灵活性；可以根据所需的组装效率和预定需求来匹配相应的方案。一般来说：a. 组装 1-4 个插入片段不需要循环；37℃ 恒温孵育即可。b. 对于多个插入片段，使用 1 分钟温度的循环组装即可。c. 对于较大规模组装（> 10 个插入片段）和任何需要最大组装效率和最大转化效率的组装来说，使用 5-10 分钟温育步骤的循环组装效果最佳。d. 无论有多少插入片段，只要条件允许，任何 Golden Gate 组装都可以在 37℃ 5 分钟 → 16℃ 10 分钟的条件下过夜完成 30 个循环；也就是说，使用较长的操作流程没有不利之处。
    • 应检查插入片段内部是否存在 BsaI 位点。（使用 NEB Golden Gate 组装工具时会自动完成此操作，goldengate.neb.cn）虽然内部有 BsaI 位点的插入片段仍可用于组装，但效率会比通过沉默突变去除内部位点的插入片段低。如果存在单个内部位点，则省略最后 55℃ 温育 5 分钟的步骤，以筛选更多菌落来鉴定正确的组装。
    • 对于插入片段的预克隆，推荐使用 NEB PCR 克隆试剂盒，因为该试剂盒的 pMiniT 2.0 载体骨架不存在 BsaI 位点。
    • 虽然 dcm 甲基化（序列 CCAGG 或 CCTGG 中胞嘧啶 C5 位置的甲基化）与酶切位点重叠阻断 BsaI 酶切，但这对于 Golden Gate 组装来说这通常不是问题。常用的目的载体设计为在 BsaI GGTCTC 识别位点前不包含上游 CC（A 或 T）碱基，以避免产生 dcm 甲基化与酶切位点重叠的情况。
    Golden Gate 组装中使用的限制性内切酶
     
    Golden Gate 组装预混液 |

ridge® 连接酶预混液 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

NEBridge 连接酶预混液为 3X 浓度剂型，适用于 Golden Gate 组装。该预混液专为搭配使用 NEB IIS 型限制性内切酶而设计，经优化的反应缓冲液含有 T4 DNA 连接酶和专有连接增强剂。用户只需选择 NEB IIS 型限制性内切酶，并添加要组装的 DNA 底物即可。该产品与其操作方案可支持简单的单片段插入，也支持中等复杂（3 – 6 个片段）和高度复杂（7 – 25+ 个片段）的片段组装。

图：使用 NEBridge 连接酶预混液和常规 T4 DNA 连接酶缓冲液对 lac 基因进行 25 个片段的 Golden Gate 组装

ridge® 连接酶预混液 |

A：使用 NEBridge 连接酶预混液对 lac 基因进行 25 个片段的 Golden Gate 组装示意图

B：使用 BbsI-HF（NEB #R3539M）、24 个插入片段和 pGGAselect 质粒建立 30 µl 反应体系。左图平板为使用 10 µl NEBridge 连接酶预混液的结果。右图平板为使用 3 µl 10X T4 DNA 连接酶缓冲液（NEB #B0202）和 1 µl T4 DNA 连接酶（NEB #M0202T/M）的结果。两个反应分别加入 1 µl BbsI-HF，以及 24 个插入片段和 pGGAselect 质粒（每种 0.05 pmol）。反应按 37℃ 5 分钟和 16℃ 5 分钟的条件进行 60 个循环，最后以 60℃ 温育 5 分钟。每个反应取 2 µl 反应物转化到 50 µl T7 表达大肠杆菌感受态细胞（NEB #C2566）中。取 50 µl 复苏菌液涂到 LB 平板上（含 1 mg/ml 葡萄糖、1 mg/ml MgCl2、30 µg/ml 氯霉素、200 µM IPTG 和 80 µg/ml X-gal），以 37℃ 温育 18 小时，以 4℃ 储存 4 小时，最后根据菌落颜色表型进行计数。

C：结果显示了总转化株数量和正确组装转化株（蓝色菌落）百分比的平均值（三个重复），以及平均值的标准偏差。使用 NEBridge 连接酶预混液时，每微克载体 DNA 产生 2.2±0.2X106 个正确组装的蓝色菌落，保真度为 94.3±1%，而使用 T4 DNA 连接酶缓冲液时，每微克载体 DNA 产生 8.3±2.1X105 个正确组装的蓝色菌落，保真度为 69.8±10.7%。

参考文献

V. Potapov et al., Comprehensive Profiling of Four Base Overhang Ligation Fidelity by T4 DNA Ligase and Application to DNA Assembly. ACS Synth Biol 7, 2665–2674 (2018).

 
产品类别:
DNA Ligases Products,
DNA Assembly, Cloning and Mutagenesis Kits Products

应用:
High-throughput cloning and automation solutions,
NEBridge® Golden Gate Assembly

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M1100S     -20    
        NEBridge® Ligase Master Mix M1100SVIAL -20 1 x 0.25 ml 3 X
    • M1100L     -20    
        NEBridge® Ligase Master Mix M1100LVIAL -20 1 x 1.25 ml 3 X

  • 特性和用法

    需要但不提供的材料

    • 用户定义的 DNA 片段
    • 用户选择的 NEB IIS 型限制性内切酶
    • 感受态细胞
    • 其它转化材料

  • 优势和特性

    Features

    • 经优化设计，适用于方便、高效、准确的 Golden Gate 组装
    • 搭配 NEB IIS 型限制性内切酶使用
    • 用于无缝克隆 – 组装后不存在多余序列残留
    • 适用于在单个反应中同时进行多片段（2 – 25+ 个）有序组装
    • 也可用于单插入片段克隆和文库制备
     

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    • NEBridge® Golden Gate 组装试剂盒（BsmBI-v2）
    • NEBridge® Golden Gate 组装试剂盒（BsaI-HF®v2）
    • BbsI-HF®
    • r3733-bsaI-hf-v2
    • BsmBI-v2
    • Esp3I
    • PaqCI
    • SapI
    • BspQI

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Protocol for NEBridge® Ligase Master Mix (NEB #M1100)
    2. Golden Gate Assembly Protocol using PaqCI® (NEB #R0745) and NEBridge Ligase Master Mix (NEB #M1100)

  • 使用指南

    • NEBridge® Ligase Master Mix Protocol Guidelines

  • 应用实例

    • Accelerating DNA Construction to Protein Expression: A Rapid 1-Day Workflow Using NEBridge® Golden Gate Assembly 

工具 & 资源

  • 选择指南

    • DNA Ligase Selection Chart
    • Synthetic Biology/DNA Assembly Selection Chart

  • Web 工具

    • NEBridge® Golden Gate Assembly Tool
    • NEBioCalculator®
    • NEBridge® Ligase Fidelity Tools

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Can Type IIS restriction enzymes from other companies be used with NEBridge Ligase Master Mix?
    2. Can I assemble PCR amplicons instead of pre-cloned inserts using Golden Gate Assembly protocols and products?
    3. How does NEBridge Ligase Master Mix perform in Golden Gate Assembly? How does it compare to “home brew” protocols?
    4. I observed high backgrounds with empty vector when using NEBridge Ligase Master Mix. What should I do?
    5. My NEBridge Ligase Master Mix has frozen in my freezer. Is this a problem?
    6. Can NEBridge Ligase Master Mix reactions be inactivated by heating?
    7. Can I use the NEBridge Ligase Master Mix reaction to transform electrocompetent cells?
    8. Which restriction enzymes are used in Golden Gate Assembly?
    9. What affects the efficiency of Golden Gate Assembly?