标签归档：连接酶

9°N™ DNA 连接酶 |NEB酶试剂 New England Biolabs

发表于由

上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

9°N™ DNA 连接酶是具有热稳定性的连接酶，可催化两条相邻 DNA 链的 5´ 磷酸末端和 3´ 羟基末端之间形成磷酸二酯键，这两条 DNA 链需要与互补 DNA 链进行杂交和准确互补配对，且没有缺口。9°N DNA 连接酶使用 ATP 作为辅因子，在更高的温度（45℃ – 70℃）下具有活性。

产品来源

从大肠杆菌菌株中纯化获得，携带有克隆自极端嗜热海洋古菌（marine archaea）热球菌（Thermococcus）属（菌株 9°N）的连接酶基因。古菌分离自赤道以北东太平洋海隆处 2500 米深的海底火山口（1）。

产品类别:
DNA Ligases Products

应用:
Cloning Ligation

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0238S     -20    
        9°N™ DNA Ligase M0238SVIAL -20 1 x 0.063 ml 40,000 units/ml
        9°N DNA Ligase Reaction Buffer B0238SVIAL -20 1 x 1 ml 10 X

  • 特性和用法

    单位定义

    （粘性末端单位）1 单位是指在 45℃ 条件下，当总反应体积为 50 µl 时，15 分钟能连接 50% 的 1 µg BstEII 酶切 λ DNA 的 12 碱基对粘性末端所需的酶量。一个粘性末端单位相当于一个切刻闭合单位（1）。

    反应条件

    1X 9°N DNA 连接酶反应缓冲液
    Incubate at 45°C

    1X 9°N DNA 连接酶反应缓冲液
    1 mM Tris-HCl
    (pH 7.5 @ 25°C)

    使用浓度

    40,000 units/ml

    贮存溶液

    10 mM Tris-HCl
    50 mM KCl
    1 mM DTT
    0.1 mM EDTA
    200 µg/ml Recombinant Albumin
    50% Glycerol
    10 mM ammonium sulfate
    pH 7.4 @ 25°C

    热失活

    否

    单位活性检测条件

    1X 9°N DNA 连接酶反应缓冲液和 20 µg/ml BstEII 酶切 λ DNA，反应体积为 50 µl。在 45℃ 下温育 15 分钟后，通过添加停止酶促反应的染料（50% 甘油，50 mM EDTA 和溴酚蓝）来终止反应，在 70℃ 下加热 10 分钟，然后上样到 0.7% 的琼脂糖凝胶上。由于存在连接酶，BstEII 酶切 λ DNA 的粘性末端将在 70℃ 热处理后保持在一起。

  • 优势和特性

    应用特性

    • 使用连接酶检测反应和连接酶链式反应进行等位基因特异性基因检测（2,4）。
    • 在 PCR 扩增过程中掺入磷酸化寡核苷酸进行突变（5）。

  • 注意事项

    1. 9°N DNA 连接酶不能替代 T4 DNA 连接酶。粘性末端单位相当于 Barany 等人提出的切刻闭合单位。
    2. 在 1X 9°N DNA 连接酶反应缓冲液中以 45℃ 温育 DNA 和酶 15 分钟；或在热循环仪中温育 DNA 和酶，温育程序适用于 Barany 在《Genetic Disease Detection and DNA Amplification Using Cloned Thermostable Ligase》（利用克隆的热稳定连接酶进行遗传病检测和 DNA 扩增）（1991 年）中描述的反应。Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 189-193. 用 50% 甘油、50 mM EDTA、溴酚蓝的混合物终止反应。
    3. 9°N will not ligate short 4-base overlaps (typical of restriction enzyme digests), while it efficiently ligates 12-base pair overlaps.

  • 参考文献

    1. Thermococcus sp. (strain 9°N-7) isolated by Dr. Holger Jannasch (1991). Woods Hole Oceanographic Institute.
    2. Barany, F. (1991). Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 88, 189-193.
    3. Takahashi, M. et al. (1984). J. Biol. Chem.. 259, 10041-10047.
    4. Barany, F. (1991). TheLigase Chain Reaction in a PCR World. (pp. 5-16, Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory.
    5. Michael, S.F. (1994). Biotechniques. 16, 411-412.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Protocol for 9°N DNA Ligase (M0238)

  • 使用指南

    • Tips for Maximizing Ligation Efficiencies

工具 & 资源

  • 选择指南

    • DNA Ligase Selection Chart
    • Properties of DNA and RNA Ligases

  • Web 工具

    • NEBcloner®
    • NEBioCalculator®

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. What is LCR and which enzymes do you recommend?
    2. What is LDR and how does it differ from LCR?
    3. How can I design probes for LDR or LCR to maximize specificity?
    4. Do thermostable DNA ligases (such as Taq DNA Ligase, 9°N DNA Ligase, and HiFi Taq DNA Ligase) ligate sticky ends?

  • 问题解决指南

    • Troubleshooting Tips for Ligation Reactions

E. coli DNA 连接酶 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

E. coli DNA 连接酶催化相邻双链 DNA 粘性末端的 5´-磷酸和 3´-羟基形成磷酸二酯键。不能有效连接平末端底物。E. coli DNA 连接酶以 NAD 作为辅因子，可以热失活。在 4-37℃ 范围内，E. coli DNA 连接酶均有活性。

重点

  • 比活性：6,000 units/mg
  • 随附 10X 反应缓冲液

产品来源

纯化自大肠杆菌菌株，其携带有克隆 E. coli DNA 连接酶基因。

产品类别:
DNA Ligases Products

应用:
Non-Cloning Ligation

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0205S     -20    
        E. coli DNA Ligase M0205SVIAL -20 1 x 0.02 ml 10,000 units/ml
        E. coli DNA Ligase Reaction Buffer B0205SVIAL -20 1 x 1 ml 10 X
    • M0205L     -20    
        E. coli DNA Ligase M0205LVIAL -20 1 x 0.1 ml 10,000 units/ml
        E. coli DNA Ligase Reaction Buffer B0205SVIAL -20 1 x 1 ml 10 X

  • 特性和用法

    单位定义

    1 单位是指在 20 μl 总反应体系，1X E. coli DNA 连接酶反应缓冲液中，16℃ 条件下 30 分钟能使 50% 的经 HindIII 消化的 λ DNA 片段 [5´ DNA 末端浓度为 0.12 μM (300 μg/ml)] 连接所需的酶量。

    反应条件

    1X E. coli DNA 连接酶反应缓冲液
    Incubate at 16°C

    1X E. coli DNA 连接酶反应缓冲液
    30 mM Tris-HCl
    4 mM MgCl2
    26 µM NAD
    1 mM DTT
    50 µg/ml Recombinant Albumin
    (pH 8 @ 25°C)

    使用浓度

    10,000 units/ml

    贮存溶液

    10 mM Tris-HCl
    50 mM KCl
    1 mM DTT
    0.1 mM EDTA
    200 µg/ml Recombinant Albumin
    50% Glycerol
    pH 7.4 @ 25°C

    热失活

    65°C for 20 minutes

  • 优势和特性

    应用特性

    • Okayama 和 Berg 的 cDNA 克隆（3）

  • 相关产品

    相关产品

    • t1010-monarch-plasmid-miniprep-kit
    • Monarch® DNA 胶回收试剂盒
    • Monarch® PCR & DNA 纯化试剂盒（5 μg）

  • 注意事项

    1. 与其它使用 rATP 的连接酶不同，该连接酶以 NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）作为辅因子。
    2. 该酶对平末端片段的连接效率极低。建议使用 T4 DNA 连接酶连接平末端片段。
    3. 不能将 RNA 连接到 DNA（4）。
    4. 该酶只能连接具有粘性末端的 DNA 片段。

  • 参考文献

    1. Panasenko, S.M. et al. (1977). Science. 196, 188-189.
    2. Panasenko, S.M. et al. (1978). J. Biol. Chem.. 253, 4590-4592.
    3. Okayama, H. and Berg, P. (1982). Mol. Cell. Biol.. 2, 161-170.
    4. Higgins, N.P. and Cozzarelli, N.R. (1979). R. Wu(Ed.), MethodsEnzymol.. 68, 50-71. New York: Academic Press.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. E. coli DNA Ligase Protocol (M0205)

  • 使用指南

    • Activity of DNA Modifying Enzymes in rCutSmart™ Buffer
    • Tips for Maximizing Ligation Efficiencies

工具 & 资源

  • 选择指南

    • DNA Ligase Selection Chart
    • Properties of DNA and RNA Ligases

  • Web 工具

    • NEBcloner®
    • NEBioCalculator®

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. How does E. coli DNA Ligase (NEB# M0205) differ from T4 DNA Ligase (NEB# M0202)?
    2. Which ligase should I use?
    3. Will E. coli DNA Ligase work in rCutSmart Buffer?

  • 问题解决指南

    • Troubleshooting Tips for Ligation Reactions

Hi-T4™ 耐热 DNA 连接酶 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

如需了解 NEB DNA 连接酶产品质量控制的详细信息，请访问连接酶质控页面。

Hi-T4™ 耐热 DNA 连接酶是 T4 DNA 连接酶的耐热突变体，可催化双链 DNA 或 RNA 中相邻的 5´ 磷酸末端和 3´ 羟基末端之间形成磷酸二酯键，比野生型 T4 DNA 连接酶更耐高热条件。Hi-T4 耐热 DNA 连接酶可在高达 50℃ 的条件下连接平末端和粘性末端，并修复双链 DNA、RNA 或 DNA/RNA 杂交体中的单链切刻。

图 1：Hi-T4 耐热 DNA 连接酶的耐热性优于 T4 DNA 连接酶。

Hi-T4™ 耐热 DNA 连接酶 |

 
400 单位 T4 DNA 连接酶（NEB #M0202）或 Hi-T4 耐热 DNA 连接酶（NEB #M2622）在无 DNA 底物的 1X T4 DNA 连接酶缓冲液中，以 45℃ 预温育指定时长。加入 0.12 μM HindIII（粘性末端）荧光标记片段，并以 37℃ 温育 15 分钟，测试连接酶的剩余活性。连接产物经毛细管电泳分析。

T4 DNA 连接酶在 45℃ 时逐渐失去活性，而 Hi-T4 耐热 DNA 连接酶即使在 45℃ 温育 72 小时后在连接粘性末端底物上仍保持完全活性。

 

图 2：Hi-T4 耐热 DNA 连接酶对更高温度循环的耐受性优于 T4 DNA 连接酶。

Hi-T4™ 耐热 DNA 连接酶 |

Hi-T4™ 耐热 DNA 连接酶 |

在 1X T4 DNA 连接酶缓冲液中，分别用 1,000 单位 T4 DNA 连接酶（NEB #M0202）或 Hi-T4 耐热 DNA 连接酶（NEB #M2622）与 DNA（1 μg pBR322）进行循环温浴。循环温度设置为：42℃（A）或 50℃（B）5 分钟，16℃ 5 分钟。在指定的循环次数（0、15、30、45 或 60 次）之后，以荧光标记的粘性末端底物（HindIII 突出末端，25℃ 时 10 分钟）检测连接酶活性。连接产物经毛细管电泳分析。图中显示了连接酶的剩余活性（相对于 0 循环数据点）。

A：在 16℃ 和 42℃ 条件下，T4 DNA 连接酶经过循环后逐渐失去活性（金黄线，A），而 Hi-T4 耐热 DNA 连接酶在此温度条件下经过 60 次循环后仍保持活性（橙红线，A）。

B：在 16℃ 和 50℃ 的 15 次循环后，T4 DNA 连接酶就完全失去活性（金黄线，B），而 Hi-T4 耐热 DNA 连接酶在此温度条件下经过 60 次循环后仍保持约 60% 的活性（橙红线，B）。

重点

  • 经基因工程改造的 T4 DNA 连接酶耐热突变体
  • 从重组酶中分离

产品来源

An E. coli strain that carries a plasmid encoding the engineered Hi-T4 DNA Ligase gene.

产品类别:
DNA Ligases Products

应用:
BioBrick® Assembly,
Cloning Ligation,
NEBridge® Golden Gate Assembly

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M2622S     -20    
        Hi-T4™ DNA Ligase M2622SVIAL -20 1 x 0.05 ml 400,000 units/ml
        T4 DNA Ligase Reaction Buffer B0202SVIAL -20 1 x 1 ml 10 X
        StickTogether™ DNA Ligase Buffer B0535AVIAL -20 1 x 1 ml 2 X
    • M2622L     -20    
        Hi-T4™ DNA Ligase M2622LVIAL -20 1 x 0.25 ml 400,000 units/ml
        T4 DNA Ligase Reaction Buffer B0202SVIAL -20 1 x 1 ml 10 X
        StickTogether™ DNA Ligase Buffer B0535AVIAL -20 3 x 1 ml 2 X

  • 特性和用法

    单位定义

    1 单位是指在 25℃ 条件下，当总反应体积为 20 µl 时，30 分钟内能连接 50% 的 6 µg Lambda-HindIII 消化后的 DNA 所需的酶量。

    反应条件

    1X T4 DNA 连接酶反应缓冲液
    Incubate at 25°C

    1X T4 DNA 连接酶反应缓冲液
    50 mM Tris-HCl
    10 mM MgCl2
    1 mM ATP
    10 mM DTT
    (pH 7.5 @ 25°C)

    贮存溶液

    10 mM Tris-HCl
    50 mM KCl
    1 mM DTT
    0.1 mM EDTA
    50% Glycerol
    pH 7.4 @ 25°C

    热失活

    65°C for 10 minutes

  • 优势和特性

    Features

    • 限制性酶切片段的克隆
    • 将连接子（linkers）和接头（adapters）连接到 DNA 片段的平末端

  • 相关产品

    相关产品

    • 快速末端平齐化™ 试剂盒
    • t1010-monarch-plasmid-miniprep-kit
    • Monarch® DNA 胶回收试剂盒
    • Monarch® PCR & DNA 纯化试剂盒（5 μg）
    • T4 DNA Ligase
    • Nuclease-free Water

    单独销售的组分

    • T4 DNA 连接酶反应缓冲液

  • 注意事项

    1. ATP 是反应中必不可少的辅因子。这与需要 NAD 作为辅因子的 E. coli DNA 连接酶不同。
    2. 若需稀释 Hi-T4 耐热 DNA 连接酶，随后 -20℃ 储存，推荐使用含 50% 甘油的贮存缓冲液（稀释液 A，NEB #B8001S）；如稀释后立即使用，也可使用 1X T4 DNA 连接酶反应缓冲液。

    3. 连接温度

      连接粘性末端（建议用 1X T4 DNA 连接酶缓冲液）：在 20 µl 反应体系中加入 1 µl Hi-T4 耐热 DNA 连接酶，在 25-50℃ 条件下温育 10 分钟。连接平末端或单碱基突出末端（建议用 1X StickTogether DNA 连接酶缓冲液）：在 20 µl 的反应体系中加入 1 µl Hi-T4 耐热 DNA 连接酶，在 25-50℃ 条件下温育 10 分钟。切勿通过加热来终止反应，因为 StickTogether DNA 连接酶缓冲液中的 PEG 受热会抑制转化。

  • 参考文献

    1. Engler, M.J. and Richardson, C.C. (1982). P.D. Boyer(Ed.), 5, San Diego: Academic Press.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Protocol for Hi-T4™ DNA Ligase (NEB #M2622)

  • 使用指南

    • Activity of DNA Modifying Enzymes in rCutSmart™ Buffer

工具 & 资源

  • 选择指南

    • DNA Ligase Selection Chart
    • NEB Diluent and Buffer Table
    • Properties of DNA and RNA Ligases
    • Substrate-based Ligase Selection Chart

  • Web 工具

    • NEBioCalculator®

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. What are some causes of ligation reaction failure that can lead to transformation failure?
    2. When should Hi-T4 DNA Ligase be the enzyme of choice?
    3. Which buffer should I use with Hi-T4 DNA Ligase?
    4. What is the activity of Hi-T4 DNA Ligase in other buffers?
    5. Can this ligase be heat inactivated?
    6. What is the difference between the unit definitions of T4 DNA Ligase (NEB #M0202) and Hi-T4 DNA Ligase (NEB #M2622)?
    7. How much DNA should be used in a ligation using this ligase?

Salt-T4® 耐盐 DNA 连接酶 |NEB酶试剂 New England Biolabs

发表于由

上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

如需了解 NEB DNA 连接酶产品质量控制的详细信息，请访问连接酶质控页面。

Salt-T4 耐盐 DNA 连接酶是 T4 DNA 连接酶的耐盐突变体，可催化双链 DNA 或 RNA 中相邻的 5´ 磷酸末端和 3´ 羟基末端形成磷酸二酯键，比野生型 T4 DNA 连接酶更耐受高盐条件。该酶在盐浓度高达 300 mM 的情况下仍能连接粘性末端，不会丧失任何活性。该酶对其它反应组分（载体或 DNA 插入片段）携带的盐不敏感，并允许连接反应在盐浓度较高的替代反应缓冲液（如 NEBuffer 3.1）中进行。

图 1：与 T4 DNA 连接酶相比，Salt-T4 耐盐 DNA 连接酶对粘性末端底物表现出更高的耐盐性。

Salt-T4® 耐盐 DNA 连接酶 |

取 400 单位的 T4 DNA 连接酶（NEB #M0202）或 Salt-T4 耐盐 DNA 连接酶（NEB #M0467）与 0.12 μM 荧光标记的 HindIII 酶切片段（粘性末端），在盐量梯度（0 – 1000 mM NaCl）的 1X T4 DNA 连接酶缓冲液中 25℃ 温育 10 分钟。连接产物经毛细管电泳分析。
当盐浓度超过 200 mM 时，T4 DNA 连接酶的活性迅速丧失；当盐浓度高达 500 mM 时，Salt-T4 耐盐 DNA 连接酶连接粘性末端底物的活性仍保留 > 60%以上。

产品来源

大肠杆菌菌株，携带有编码经基因工程改造的 Salt-T4 耐盐 DNA 连接酶基因的质粒。

产品类别:
DNA Ligases Products

应用:
BioBrick® Assembly,
Cloning Ligation,
NEBridge® Golden Gate Assembly

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0467S     -20    
        Salt-T4® DNA Ligase M0467SVIAL -20 1 x 0.05 ml 400,000 units/ml
        T4 DNA Ligase Reaction Buffer B0202SVIAL -20 1 x 1 ml 10 X
        StickTogether™ DNA Ligase Buffer B0535AVIAL -20 1 x 1 ml 2 X
        NaCl B5019AVIAL -20 1 x 1 ml 1,000 mM
    • M0467L     -20    
        Salt-T4® DNA Ligase M0467LVIAL -20 1 x 0.25 ml 400,000 units/ml
        T4 DNA Ligase Reaction Buffer B0202SVIAL -20 1 x 1 ml 10 X
        StickTogether™ DNA Ligase Buffer B0535AVIAL -20 3 x 1 ml 2 X
        NaCl B5019AVIAL -20 1 x 1 ml 1,000 mM

  • 特性和用法

    单位定义

    1 单位是指在 20 µl 反应体系中，含 100 mM NaCl 的 1X T4 DNA 连接酶反应缓冲液条件下，25℃ 温浴 30 分钟能连接 50% 的 6 µg HindIII 消化的 Lambda DNA 所需的酶量。

    反应条件

    1X T4 DNA 连接酶反应缓冲液
    Incubate at 25°C

    T4 DNA 连接酶反应缓冲液
    50 mM Tris-HCl
    10 mM MgCl2
    1 mM ATP
    10 mM DTT
    (pH 7.5 @ 25°C)

    贮存溶液

    10 mM Tris-HCl
    50 mM KCl
    1 mM DTT
    0.1 mM EDTA
    50% Glycerol
    pH 7.4 @ 25°C

    热失活

    65°C for 10 minutes

  • 优势和特性

    Features

    • 限制性酶切片段的克隆
    • 将连接子（linkers）和接头（adapters）连接到 DNA 片段的平末端

  • 相关产品

    相关产品

    • 快速末端平齐化™ 试剂盒
    • t1010-monarch-plasmid-miniprep-kit
    • Monarch® DNA 胶回收试剂盒
    • Monarch® PCR & DNA 纯化试剂盒（5 μg）
    • T4 DNA Ligase
    • Nuclease-free Water

    单独销售的组分

    • T4 DNA 连接酶反应缓冲液

  • 注意事项

    1. ATP 是反应中必不可少的辅因子。这与需要 NAD 作为辅因子的 E. coli DNA 连接酶不同。
    2. 若需将 Salt-T4 耐盐 DNA 连接酶稀释随后以 -20℃ 储存，推荐使用含 50% 甘油的贮存缓冲液（稀释缓冲液 A，NEB #B8001S）；如稀释后立即使用，也可使用 1X T4 DNA 连接酶反应缓冲液。

    3. 连接温度

      为方便起见，连接可在室温（20 – 25℃）条件下进行。连接粘性末端（1X T4 DNA 连接酶缓冲液）：在 20 µl 反应体系中加入 1 µl Salt-T4 耐盐 DNA 连接酶，反应 10 分钟。连接平末端或单碱基突出末端（1X StickTogether™ DNA 连接酶缓冲液）：在 20 µl 反应体系中加入 1 µl Salt-T4 耐盐 DNA 连接酶，反应 10 分钟。切勿通过加热来终止反应，因为 StickTogether™ DNA 连接酶缓冲液中的 PEG 受热会抑制转化。

  • 参考文献

    1. Engler, M.J. and Richardson, C.C. (1982). P.D. Boyer(Ed.), 5, San Diego: Academic Press.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Protocol for Salt-T4® DNA Ligase (NEB #M0467)

  • 使用指南

    • Activity of DNA Modifying Enzymes in rCutSmart™ Buffer

工具 & 资源

  • 选择指南

    • DNA Ligase Selection Chart
    • NEB Diluent and Buffer Table
    • Properties of DNA and RNA Ligases
    • Substrate-based Ligase Selection Chart

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. What are some causes of ligation reaction failure that can lead to transformation failure?
    2. When should Salt-T4 DNA Ligase be the enzyme of choice?
    3. Which buffer should I use with Salt-T4 DNA Ligase?
    4. What is the activity of Salt-T4 DNA Ligase in other buffers?
    5. Can this ligase be heat inactivated?
    6. What is the difference between the unit definitions of T4 DNA Ligase (NEB #M0202) and Salt-T4 DNA Ligase (NEB #M0467)?
    7. How much DNA should be used in a ligation using this ligase?
    8. Does Salt-T4 DNA Ligase have a higher tolerance to salt than other ligases?
    9. Can the ligation reaction produced by Salt-T4 DNA Ligase be directly used to transform electrocompetent cells?