质谱级赖氨酰肽链内切酶

Lysyl Endopeptidase^®

　　本产品是质谱分析前处理时常用的蛋白分解酶即赖氨酰肽链内切酶，该酶可以特异性切除赖氨酸基团C末端的多肽，可用于蛋白测序分析和 Lys-X 化合物的酶合成。若同时使用赖氨酰肽链内切酶和胰酶，可更好地切断赖氨酸基团的多肽，增加多肽的数量。产品已按照使用习惯做成小包装，是方便使用的冷冻干燥品。20 μg/支可用于100-200个样品的凝胶内消化。

来源：细菌

外观：冻干粉（包含２ mmol/L Tris-HCl 缓冲液，pH８）

活性：0.03～0.07 AU/vial

分子量：27,000（琼脂糖过滤），30,000（SDS-PAGE）

溶解性：溶于水或缓冲液

稳定性：溶解于 pH 值 5.0-12.0 的 Tris 缓冲液中，可在４℃稳定保存２年；在 pH 值 6.0-11.0、30℃时能稳定保存，但温度超过50℃时不稳定。

最适pH值：9.0~9.5

等电点：6.9~7.0 

底物特异性：

可水解底物——Tos-Lys-OMe、Bz-Lys-NH₂、Bz-Lys-pNA、Lys-pNA

不可水解底物——Bz-Arg-NH₂、Bz-Arg-pNA、Arg-pNA

抑制剂：DFP、PMSF、TLCK

◆特点

●  高特异性、高蛋白质消化率、适用于蛋白质谱分析

●  提高裂解效率、增加肽段数量

●  根据使用量特意制备小包装，方便使用

◆应用

　　分别采用胰蛋白酶（Tp）、赖氨酰肽链内切酶（Lys-C）和 Tp与Lys-C 联用进行胶内酶切的效果比较。

　　牛血清蛋白 BSA 的条带（100 ng）通过 SDS-PAGE 获得，然后分别用 Tp、Lys-C 和 Lys-C+Tp 进行酶切，再用 MALDI-TOFMS 法进行分析。

　　这些蛋白酶的实验效果见下表。

表 1：Tp、Lys-C 和 Lys-C+Tp 的结果对照

这些结果表明 Lys-C 酶解的错误裂解率最低。Tp 酶解时加入 Lys-C 后，错误裂解率有所降低，同时，可以鉴定出更多的多肽。

胰蛋白酶（Tp）（图 ａ）和赖氨酰肽链内切酶（Lys-C）+Tp（ 图 ｂ）酶切后的质谱结果对照图。

Lys-C+Tp 酶切后，可以在 m/z=2000 时得到吸收峰，而单独的 Tp 酶切在 m/z=2000 时没有吸收峰。该结果表明 Lys-C 可以提高测序覆盖度。

( 数据由大阪医疗中心和妇婴健康研究所Ｙ. Wada 博士提供 )

赖氨酰肽链内切酶

　　赖氨酰肽链内切酶，最初由 Masaki 等人从土壤细菌中分离得到。该酶可以特异性剪切赖氨酸残基Ｃ末端和Ｓ-氨乙基半胱氨酸残基的肽键，用于蛋白测序和 Lys-X 化合物的酶催化合成。该酶稳定性高，在４Ｍ尿素或 0.1% SDS 溶液中 30℃ 孵育６小时之后，仍然拥有完整的生物活性。

实验方法

1. 试剂：

A．0.2 mol/L AMP 缓冲液，pH值 9.5

      溶解 4.2 g 的２-氨基-２-甲基-１,３-丙二醇于 150 mL 的水中，加入1 mol/L HCl 调 pH 值至 9.5，再加水使体积至 200 mL。

B．2.5 mmol/L 底物溶液

      溶解 22.6 mg 的Ｎ-苯甲酰基-ＤＬ-精氨酰-４-硝基苯胺盐酸盐于 20 mL 水中。

C.   2 mmol/L Tris-HCl 缓冲液，pH８

      溶解 0.24 mg的２-氨基-２-羟甲基-１,３-丙二醇于 900 mL 水中，加入 0.1 mol/L HCl 调pH值至8，再加水使体积至１ L。

D.   酶溶液

      溶解１vial 的赖氨酰肽链内切酶于１mL 的溶剂Ｃ中，可直接加入。

E． 终止溶液

      将 55 mL 水和 45 mL 乙酸混合均匀。

2. 步骤

3. 单位的定义

酰胺酶单位是指 30℃、pH 9.5 时，每分钟产生１μmol 对硝基苯胺的酶量。

AU/vial = [(a-b) / 25] × (1/9.62) × (4.0/0.1)

a.    检测样品中的吸光度

b.    空白对照中的吸光度

胶内酶切的实验操作流程

　　用聚硅酮处理的微量离心管和吸管端防止捕获任何蛋白。使用质谱分析用凝胶染色试剂盒，例如银染剂 MS 试剂盒（产品编号：299-58901）和负凝胶染色 MS 试剂盒（产品编号：293-57701）

1.    电泳分离蛋白质样品；

2.    从凝胶中切割蛋白质片断并放入微量离心管；

3.    使凝胶脱色（可使用质谱分析用凝胶染色试剂盒中的脱色溶液）；

4.    加入300 μL 乙腈到试管里，搅拌器振荡 30 分钟；

5.    去除乙腈，用 Parafilm 膜覆盖微量离心管。

6.    在 Parafilm 膜上打出针孔，真空干燥 15 分钟；

7.    100 μL 10 mmol/L DTT 溶解于 100 mmol/L 碳酸氢铵，56℃恒温１小时。

8.    室温冷却后，用等量的 50 mM 碘乙酰胺溶解于 100 mmol/L 碳酸氢铵，暗处恒温 45 分钟并涡旋；

9.    用 100 μL 100 mmol/L 碳酸氢铵洗涤凝胶片段 10 分钟；

10.  用 300 μL 乙腈干燥凝胶片段 15 分钟；

11.  用 100 μL 100 mmol/L 碳酸氢铵溶胀凝胶片段 15 分钟；

12.  用 300 μL 乙腈再次干燥凝胶片段 15 分钟；

13.  去除液相，真空干燥凝胶片段 15 分钟；

14.  用 100 μL 赖氨酸内切酶溶液*在冰水浴中溶胀凝胶片段 45 分钟；

　　*赖氨酸内切酶稀释于 50 mmol/L Tris-HCl  pH 8.5；

15.  去除 100 μL 赖氨酸内切酶溶液，将凝胶片段放在 37℃、10 μL 50 mmol/L Tris-HCl pH 8.5 中过夜；

16.  加入 50 μL 20mmol/L 碳酸氢铵 20 分钟内振荡凝胶片段３次抽提多肽；

17.  加入 5% 甲酸/50% 乙腈 20 分钟内振荡凝胶片段３次抽提多肽；

18.  如果需要用 Speed Vac. 浓缩多肽；

19.  用 ZipTip 脱盐和纯化多肽；

20.  如果需要用弱真空浓缩多肽至２ μL；

21.  加入基质进行质谱分析。

注意：根据细菌的生理和形态特征分类，产品来源为水解无色杆菌，但是最近细菌分类学将这种细菌鉴定为产酶溶杆菌。

保存：暗处－20℃保存

规格：20 μg×5 vial

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赖氨酰肽链内切酶，MS级

产品编号：125-05061

发表文献

[1]   Ojima T et al. “Characterization of Halomonas Sp. Strain H11 {alpha}-Glucosidase Activated by Monovalent Cations and Its Application for Efficient Synthesis of {alpha}-D-Glucosylglycerol.” Applied and Environmental Microbiology 78, no. 6 (March 15, 2012): 1836–1845.

[2]   Leitner A et al. “Expanding the Chemical Cross-Linking Toolbox by the Use of Multiple Proteases and Enrichment by Size Exclusion Chromatography.”Molecular and Cellular Proteomics 11, no. 3 (March 1, 2012): M111.014126.

[3]   Goetze A et al. “Rates and Impact of Human Antibody Glycation in Vivo.” Glycobiology 22, no. 2 (February 1, 2012): 221–234.

[4]   Thingholm, T et al. “Characterization of Human Myotubes From Type 2 Diabetic and Nondiabetic Subjects Using Complementary Quantitative Mass Spectrometric Methods.” Molecular and Cellular Proteomics 10, no. 9 (September 1, 2011): M110.006650.

[5]    Shoji M et al. “walK and clpP Mutations Confer Reduced Vancomycin Susceptibility in Staphylococcus Aureus.” Antimicrobial Agents and Chemotherapy 55, no. 8 (August 1, 2011): 3870–3881.

[6]    Kubota T et al. “Quantitative Proteomic Analysis of Chromatin Reveals That Ctf18 Acts in the DNA Replication Checkpoint.”Molecular and Cellular Proteomics 10, no. 7 (July 1, 2011): M110.005561.

[7]   Lee E et al. “The Steady-State Repertoire of Human SCF Ubiquitin Ligase Complexes Does Not Require Ongoing Nedd8 Conjugation.” Molecular and Cellular Proteomics 10, no. 5 (May 1, 2011): M110.006460.

[8]    Shirai Y et al. “Direct Binding of RalA to PKC{eta} and Its Crucial Role in Morphological Change During Keratinocyte Differentiation.” Molecular Biology of the Cell 22, no. 8 (April 15, 2011): 1340–1352.

[9]    Liu D et al. “N-terminal Glutamate to Pyroglutamate Conversion in Vivo for Human IgG2 Antibodies.” Journal of Biological Chemistry 286, no. 13 (April 1, 2011): 11211–11217.

[10]    Shen H et al. “Constitutive Activated Cdc42-associated Kinase (Ack) Phosphorylation at Arrested Endocytic Clathrin-coated Pits  of Cells That Lack Dynamin.” Molecular Biology of the Cell 22, no. 4 (February 15, 2011): 493–502.

[11]    Keinath N et al. “PAMP (Pathogen-associated Molecular Pattern)-induced Changes in Plasma Membrane Compartmentalization Reveal Novel Components of Plant Immunity.” Journal of Biological Chemistry 285, no. 50 (December 10, 2010): 39140–39149.

[12]    Maeda T et al. “Purification, Characterization and Amino Acid Sequence of a Novel Enzyme, D-threo-3-hydroxyaspartate Dehydratase, from Delftia Sp. HT23.” Journal of Biochemistry 148, no. 6 (December 1, 2010): 705–712.

[13]   Rajagopal C et al. “Secretion Stimulates Intramembrane Proteolysis of a Secretory Granule Membrane Enzyme.” Journal of Biological Chemistry 285, no. 45 (November 5, 2010): 34632–34642.

[14]    Sato H et al.“Novel Isonitrile Hydratase Involved in Isonitrile Metabolism.”Journal of Biological Chemistry 285, no. 45 (November 5, 2010): 34793–34802.

[15]    Manno S et al. “ATP-dependent Mechanism Protects Spectrin Against Glycation in Human Erythrocytes.” Journal of Biological Chemistry 285, no. 44 (October 29, 2010): 33923–33929.

[16]    Matsumoto T et al. “Proteomic Analysis Identifies Insulin-like Growth Factor-binding Protein-related Protein-1 as a Podocyte Product.” Renal Physiology 299, no. 4 (October 1, 2010): F776–784.

[17]    Sury M et al. “The SILAC Fly Allows for Accurate Protein Quantification in Vivo.” Molecular and Cellular Proteomics 9, no. 10 (October 1, 2010): 2173–2183.