标签归档：编程

StemRNA™ 重编程试剂盒 Stemgent® StemRNATM SR Reprogramming Kit

发表于由
  • 产品特性
  • 相关资料
  • Q&A
  • 参考文献

StemRNATM 重编程试剂盒StemRNA™ 重编程试剂盒 Stemgent® StemRNATM SR Reprogramming Kit

Stemgent® StemRNATM SR Reprogramming Kit

◆产品概况

ReproCELL 的 Stemgent® StemRNA™ -SR 重编程试剂盒是细胞重编程试剂盒，结合自身复制 RNA（srRNA）和 microRNA 技术，为干细胞研究者提供安全、灵活、快速、经济、高效重编程，可将来自人外周血、脐带血、人成熟和新生成纤维细胞的内皮祖细胞（EPCs）通过重编程转化为 IPS 细胞。

该试剂盒有３种组分                                             StemRNA™ 重编程试剂盒 Stemgent® StemRNATM SR Reprogramming Kit



●　OKSiM-srRNA

●　microRNA 重编程混合物

●　18R 重组蛋白

◆优势

●　重编程来自人外周血或者脐带血的 EPCs 的实验流程经过鉴定。

●　不含病毒或 DNA 的 OKSiM 重编程因子，包括自我复制 RNA 。

●　两种转染流程，免除了条件性培养基、共转染、小分子和饲养层细胞的需求。

●　25 天内制备来自 EPCs 和成纤维细胞的 iPS 细胞克隆。

●　流程可在６孔板内进行５种重编程。

血液来源

原代 EPC

建立效率

病人之间

重编程效率

外周血

18/22 = 82%

9/13 = 70%

脐带血

46/53 = 87%

33/41 = 81%

总

64/75 = 85%

42/54 = 78%

表 1. 来自人血液样品的 EPCs 进行有效的细胞 srRNA 重编程


来自外周血的原代 EPC 建立效率是新鲜血液和冻存的单核细胞（MNC）样品的累加。脐带血效率的数据只是来自冻存的 MNCs 。每种胶原被的 T-75 瓶最少接种 5 x 107 MNCs 。未修饰 StemRNA-SR 试剂盒步骤证明使用一个重编程实验即可得到病人之间的高效率。典型的最终结果是６孔板内每个孔有 10~20 个 iPS 细胞克隆。



◆相关产品


货号

名称

规格

00-0073

microRNA Booster Kit

microRNA增强试剂盒

1kit

00-0071

 Stemgent® mRNA Reprogramming Kit

 mRNA 重编程试剂盒

1kit

00-0075

Stemgent® StemRN™ -SR Reprogramming Kit

StemRNA™ -SR重编程试剂盒

1kit

注：本品已停产，升级版本已推出：Stemgent® StemRNA™ 3rd Generation Reprogramming Kit（又名 StemRNA-NM Reprogramming Kit，产品编号：00-0076）。

试剂盒组分

●　OKSiM-srRNA, (Part No. 05-0038), 5 µg, 1 瓶

●　microRNA Reprogramming Cocktail (20 µM) (Part No. 05-0036), 35 µL, 1 瓶

●　B18R Recombinant Protein, Carrier-Free (Cat. No. 03-0017), 50 µg, 1 瓶

 

保存

●　保存和保质期Storage and Stability

●　所有组分均保存在 -70 °C 及其以下

●　到货后至少保存３个月

 

 

质量控制

StemRNA™-SR Reprogramming Kit 可以重编程人脐静脉内皮细胞（HUVEC）。重编程的 iPS 细胞克隆用多能干细胞标志物和细胞形态进行鉴定。所有成分均经过灭菌，不含支原体。Limited Use Licenses

Limited Use License MIT
Limited Use License iPS Academia Japan

This product also uses technology licensed from the University of California – San Diego.



推荐使用

建议使用 StemRNA-SR 制备 EPC 重编程成为 iPS.

 

●　制备 EPC 需要的材料清单-点击

●　i StemRNA-SR 重编程要的材料-点击

●　ISSCR 2015 （Stockholm）海报: ISSCR2015-srRNA-mobile.pdf


 

Specification Sheets

00-0075 Product Specification Sheet

Safety Data Sheets

03-0017 Safety Data Sheet

05-0036 Safety Data Sheet

05-0038 Safety Data Sheet

Product Sheets

00-0075 Product Sheet

　

[1]

Yoshioka N; Gros E; Li H-R; Kumar S; Deacon DC; Maron C; Muortri AR; Chi NC; Fu X; Yu BD; Dowdy SF. "Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA." Cell Stem Cell 13: 246 (2013)

[2]

Geti I; Ormiston M: Touhain F; Toshner M; Movassagh M; Nichols J; Mansfield W; Southwood M; Bradley A; Rana AA; Vallier L; Morrell NW. "A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells." Stem Cells Trans med 1:855 (2012)

[3]

Yoshida Y; Takahashi K; Ishisaka T; Yamanaka S. "Hypoxia Enhances the Generation of Induced Pluripotent Stem Cells." Cell Stem Cell 5:237 (2009)


　 

　　  

产品编号 产品名称 产品规格 产品等级
00-0075 Stemgent® StemRNATM SR Reprogramming Kit
StemRNATM-SR重编程试剂盒		 1kit –

microRNA 增强试剂盒 microRNA Booster Kit

发表于由
  • 产品特性
  • 相关资料
  • Q&A
  • 参考文献

microRNA 增强试剂盒microRNA 增强试剂盒 microRNA Booster Kit

microRNA Booster Kit

◆产品概况

　　Stemgent® microRNA Booster 试剂盒增强和简化了 mRNA 的重编程，可用正常或者病人特定类型细胞制备有效的 iPS 细胞系。 microRNA Booster 试剂盒包括 microRNA 重编程混合物和 B18R 重组蛋白。

　　microRNA 增强型 mRNA 重编程方法改进了第一代 mRNA 重编程试剂盒，递送更快速的重编程动力学，流水线操作，提供了难以进行重编程类型细胞的重编程效率。 microRNA-增强型方法是 Stemgentm® RNA Reprogramming Kit 和 microRNA Booster Kit、Stemfect™ RNA Transfection Kit 配套使用，至少８天内获得原代 iPS 细胞克隆。该新方法改进了动力学，减少了每次转染 mRNA 的剂量，与基于饲养层细胞 mRNA 重编程方法相比，每个孔减少大约 35%~45% 的 mRNA 量。



◆优势

Stemgent® mRNA 重编程方法

Stemgent® microRNA 增强型 mRNA 重编程方法

重编程效率

>１%

>１%

快速重编程动力学

是

是

体细胞 → iPS 细胞

３周

２周

插入突变风险

无

无

病毒清除筛选

无

无

DNA 载体保留和/或者整合的筛选

无

无

与运用病毒相关的生物污染问题

无

无

# 每个试剂盒的孔数 of wells per kit（６孔板）

4

9-10（35%-45% /孔节省用量）

重编程底物

成纤维细胞饲养层

细胞外基质

难以重编程和重塑的细胞类型

—

是

简单，友好的操作流程 (过夜转染)

—

是

◆案例・应用


microRNA 增强试剂盒 microRNA Booster Kit

Figure 1：MicroRNA 增强型 mRNA 重编程实验时间轴。 Stemgent® microRNA 增强型 mRNA 重编程实验步骤已经经过优化，确保在２周时间内制备人 iPS 细胞并可以传代。

microRNA 增强试剂盒 microRNA Booster Kit

Figure 2：mRNA 重编程实验时间轴。TStemgent RNA 重编程实验流程优化确保在３周内制备人 iPS 细胞并可以传代。

microRNA 增强试剂盒 microRNA Booster Kit

Figure 3：使用 Stemgent-Asterand microRNA 增强型重编程系统制备人 iPS 细胞的时空图片。相差显微镜图片显示第１天细胞的形态。用 Stemgent-Asterand microRNA 增强型重编程系统制备人 iPS 细胞的时空图片。相差显微镜图片显示第１天细胞的形态。

microRNA 增强试剂盒 microRNA Booster Kit

Figure 4：使用 Stemgent-Asterand microRNA 增强型重编程系统制备人 iPS 细胞的时空图片。相差显微镜图片显示第３天细胞的形态。

microRNA 增强试剂盒 microRNA Booster Kit

Figure 5：使用 Stemgent-Asterand microRNA 增强型重编程系统制备人 iPS 细胞的时空图片。相差显微镜图片显示第５天细胞的形态。

microRNA 增强试剂盒 microRNA Booster Kit

Figure 6：使用 Stemgent-Asterand microRNA 增强型重编程系统制备人 iPS 细胞的时空图片。相差显微镜图片显示第７天细胞的形态。

microRNA 增强试剂盒 microRNA Booster Kit

Figure 7：使用 Stemgent-Asterand microRNA 增强型重编程系统制备人 iPS 细胞的时空图片。相差显微镜图片显示第９天细胞的形态。

microRNA 增强试剂盒 microRNA Booster Kit

Figure 8：使用 Stemgent-Asterand microRNA 增强型重编程系统制备人 iPS 细胞的时空图片。相差显微镜图片显示第 12 天细胞的形态。

microRNA 增强试剂盒 microRNA Booster Kit

Figure 9：使用 Stemgent-Asterand microRNA 增强型重编程系统制备人 iPS 细胞的时空图片。第 12 天，用 TRA-1-81（多能性标记物）荧光染色 iPS 细胞。

◆相关产品


货号

名称

规格

00-0073

microRNA Booster Kit

microRNA增强试剂盒

1 kit

00-0071

 Stemgent® mRNA Reprogramming Kit

 mRNA 重编程试剂盒

1 kit

00-0075

Stemgent® StemRN™ SR Reprogramming Kit

StemRNATM-SR重编程试剂盒

1 kit

注：本品已停产，升级版本已推出：Stemgent® StemRNA™ 3rd Generation Reprogramming Kit（又名 StemRNA-NM Reprogramming Kit，产品编号：00-0076）。

试剂盒成分

●　2 瓶 – microRNA Reprogramming 混合物Ⅰ（20 μM）（货号 05-0036），35 μL

●　B18R 重组蛋白，不含载体（货号. 03-0017），50 μg

 

保存和保质期 Storage and Stability

●　将 microRNA 重编程混合物和 B18R 蛋白保存在 -70℃以下。

●　按照指示的保存，收到货后至少可以保存３个月。

 

质量控制

 Stemgent® microRNA Booster 试剂盒用人新生的包皮成纤维细胞成功进行基于 RNA 重编程。所有试剂盒组分都灭过菌，检测不含支原体。


推荐使用

●　Stemgent® microRNA Booster Kit 用于 microRNA-增强型 mRNA 重编程

●　参考制备 NuFF-条件性 Pluriton 培养基用于制备条件性重编程培养基。

●　参考操作手册： Stemgent® mRNA 重编程系统，关注实验细节和材料处理。

Specification Sheets

 00-0073 Product Specification Sheet

Safety Data Sheets

03-0017 Safety Data Sheet

00-0073 Safety Data Sheet

05-0036 Safety Data Sheet

Protocols

   microRNA Enhanced mRNA Reprogramming

Application Notes

     MicroRNA Application Note

Product Sheets

      Product Sheet_RNA Reprogramming

 

Related Products

 RNA Transfection Kit (00-0069)

 mRNA Reprogramming Kit (00-0071)

 NuFF-RQ™ IRR (GSC3002G)

 XF/FF Culture Medium (01-0005)

 FGF-basic, Human Recombinant (03-0002)

 TRA-1-60 Antibody (DyLight™ 488), Mouse anti-Human (09-0068)

        TRA-1-81 Antibody (DyLight™ 488), Mouse anti-Human (09-0069)

        Nanog Antibody (Affinity Purified), Rabbit anti-Mouse/Human (09-0020)

  Oct4 Antibody (Affinity Purified), Rabbit anti-Mouse/Human (09-0023)

        SSEA-4 Antibody (Purified), Mouse anti-Human (09-0006)

        TRA-1-60 Antibody (Purified), Mouse anti-Human (09-0010)

        TRA-1-81 Antibody (Purified), Mouse anti-Human (09-0011)

        mRNA Reprogramming Factors Set: hOKSML (00-0067)

 

Additional Publications

7q11.23 dosage-dependent dysregulation in human pluripotent stem cells affects transcriptional programs in disease-relevant lineages

Josowitz R, Lu J, Falce C, D’Souza SL, Wu M, Cohen N, Dubois NC; Zhao Y; Sobie EA; Fishman GI; Gelb BD. Identification and purification of human induced pluripotent stem cell-derived atrial-like cardiomyocytes based on sarcolipin expression. PLoS ONE 9(7): e101316 (2014)

 Briggs SF; Dominguez AA; Chavez SL; Reijo Pera RA. "XIST in human preimplantation embryos and iPSCs." Stem Cells 33:1771 (2015)

 

产品编号 产品名称 产品规格 产品等级
00-0073 microRNA Booster Kit
microRNA增强试剂盒		 1 kit –

StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit StemRNA第三代重编程试剂盒

发表于由
  • 产品特性
  • 相关资料
  • Q&A
  • 参考文献

StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit StemRNA第三代重编程试剂盒

StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit

StemRNA第三代重编程试剂盒 （又名StemRNA™-NM重编程试剂盒）


Stemgent RNA重编程的新产品——StemRNA第三代重编程试剂盒（旧名StemRNA-NM重编程试剂盒），结合了未经修饰的RNA和microRNA技术，使干细胞研究人员追求的多功能性、简易性和时间效益提升到一个新的层次，使人成纤维细胞，以及来自难以重编程的患者血液和尿液的细胞样品得已重编程，成为具有全能性的诱导型多功能干细胞（iPS）。


◆主要优点

●　运用灵活技术，可从多种靶细胞得到高质量的人iPS细胞系

●　即开即用。可用于来自皮肤（成纤维细胞），血液（内皮祖细胞； EPCs）和尿液（尿源性上皮细胞； UDCs）细胞的重编程。


●　高效率的非整合重编程

●　StemRNA-3rd Gen仅需要少至四种额外的试剂。试剂盒中的双链microRNA可增强重编程效率，提高iPS获得效率（成纤维细胞高达4％，EPC高达3％，UPC高达0.5％）。


●　省时的操作更快获得结果，从而提高吞吐量

●　从成纤维细胞的细胞系中得到iPS克隆需要10-14天，而从EPC或UPC中获得细胞系需要12-16天。无需筛选，无需像其他技术般额外培养2-10周（3-10代）以清除载体。

 

StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit (00-0076)

特点

成纤维细胞

尿液 (UDCs)

血液(EPCs)

每个试剂盒可转染的孔数（6孔板）

9

3

3

转染次数

4

6-8

6-8

获得原代iPS细胞克隆所需天数

10-14

12-14

12-14

重编程效率

2-+4%

0.1-0.5%

0.4-3%

筛选

否

否

否

兼容异源成分的培养步骤

是

否

否

GMP级的RNA制备步骤

是

是

是

StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit StemRNA第三代重编程试剂盒


在NutriStem™ XF / FF培养基（01-0005）中扩增后，使用StainAlive™ TRA-1-60抗体（09-0068）和DAPI对UDCs的P7原代iPS细胞进行染色。

StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit StemRNA第三代重编程试剂盒


StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit

StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit StemRNA第三代重编程试剂盒

以StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit 配合NutriStem™ XF/FF培养基（01-0005）及iMatrix-511（NP892-011）基质上培养成纤维细胞衍生的iPS细胞7代。 放大倍数：4x

StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit StemRNA第三代重编程试剂盒


StemRNA-NM的成纤维细胞重编程s时间表



◆产品说明


规格

 1 kit

试剂盒组分

 OKSMNL NM-RNA（编号05-0040），30 µg，1 vial
 EKB NM-RNA（编号05-0041），22 µg，1 vial
 NM-microRNAs（编号05-0042），15 µg，1 vial

储存与稳定性

 1. 试剂盒三种成分均需储存在-70°C以下；
 2. 在适当的保存条件下，自到货后三个月内有效。

质量控制

 试剂盒种每种mRNA的大小与完整性均经过检测。

 StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit 成功进行了人成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞RNA基础重编程功能验证。

 iPS细胞系完全重编程可通过多能性标记物的表达及正确的形态来确认。

 试剂盒所有组分均无菌，支原体检测均呈阴性。

使用许可

 该产品使用Biontech AG独家许可技术，引自专利WO 2009/088134。

 Biontech AG的WO 2007/036366，WO 2007/036366，WO 2007/036366和WO 2007/036366等多专利也涵盖

 了本产品。

◆产品列表


产品编号

产品名称

规格

00-0076

Stemgent® StemRNA™ 3rd Generation Reprogramming Kit
    （StemRNA-NM Reprogramming Kit）

1 kit

◆相关产品

 产品编号

产品名称

包装

01-0005

NutriStem XF/FF Culture Medium (500 mL)
NutriStem 无饲养层干细胞培养基

500 mL

01-0005-100

NutriStem XF/FF Culture Medium (100 mL)

NutriStem 无饲养层干细胞培养基

100 mL

03-0002

Stemfactor™ FGF-Basic, Human Recombinant
Stemfactor™ FGF-Basic，人重组

50 µg

01-0020-50

NutriFreez D10 Cryopreservation Mediu

50 mL

iMatrix-511


产品编号

产品名称

包装

NP892-011

iMatrix-511
iMatrix-511层粘连蛋白

350 μg

NP892-012

1050 μg

NP892-013

175 μg

385-07361

iMatrix-511 solution(0.5 mg/mL)
重组层粘连蛋白511-E8片段，溶液（0.5 mg/mL）

175 μg×2


iMatrix-511产品详细信息请点击：iMatrix-511层粘连蛋白


查看相关产品宣传册，请点击：Stemgent细胞重编程

相关资料



◆视频

StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit StemRNA第三代重编程试剂盒

Stemgent mRNA 重编程试剂盒使用技巧

◆宣传页以及说明书


StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit StemRNA第三代重编程试剂盒

Stemgent_RNA Reprogramming System

StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit StemRNA第三代重编程试剂盒

血液-Protocol

StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit StemRNA第三代重编程试剂盒

尿液-Protocol

StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit StemRNA第三代重编程试剂盒

成纤维细胞-Protocol

参考文献

1. 

Poleganov MA; Eminli S; Beissert T; Herz S; Moon J-I; Goldmann J; Beyer A; Heck R; Burkhart I; Roldan DB; Tureci O; Yi K; Hamilton B; Sahin U. "Efficient reprogramming of human fibroblasts and blood-derived endothelial progenitor cells using nonmodified RNA for reprogramming and immune evasion." Human Gene Therapy 26:751 (2015)

Featured Publication

2.

Gagliano O; Luni C; Qui W; Bertin E; Torchio E; Galvanin S; Urciuolo A; Elvassore N. Microfluidic reprogramming to pluripotency of human somatic cells. Nat. Protocols 14:772-737 (2019).

 

The StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit was used to generate iPSCs from fibroblasts in a microfluidic system that used only 1500 cells in 20 µL of medium. RNA-based reprogramming is ideal for such an application since it does not require extended culture for elimination of reprogramming vectors.

Additional Publications

3.

Nakajima M; Yoshimatsu S; Sato T; Nakamura M; Okahara J; Sasaki E; Shiozawa S; Okano H. Establishment of induced pluripotent stem cells from common marmoset fibroblasts by RNA-based reprogramming. Biochem Biophys Research Commun in press:

https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2019.05.175 (2019).

4.

Watanabe T; Yamazaki S; Yoneda N; Shinohara H; Tomioka I; Iiguchi T; Tagoto M; Ema M; Suemizu H; Kawai K; Sasaki E. Highly efficient induction of primate iPS cells by combining RNA transfection and chemical compounds. Genes to Cells in press:doi:10.1111/gtc.12702 (2019).

5.

Liu L-P; Li Y-M; Guo N-N; LI S; Ma X; Zhang Y-X; Gao Y; Huang J-L; Zheng D-X; Wang L-Y; Xu H; Hui L; Zheng Y-W. Therapeutic Potential of Patient iPSC-Derived iMelanocytes in Autologous Transplantation. Cell Reports 27:455-466.e5 (2019).

6.

Sacco AM; Belviso I; Romano V; Carfora A; Schonauer F; Nurzynska D; Montagnani S; Di Meglio F; Castaldo C. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. J Cell Mol Med :1-13; https://doi.org/10.1111/jcmm.14316 (2019).

7.

Klein T; Klug K; Henkel L; Kwok CK; Edenhofer F; Klopocki E; Kurth I; Üceyler N. Generation of two induced pluripotent stem cell lines from skin fibroblasts of sisters carrying a c.1094C>A variation in the SCN10A gene potentially associated with small fiber neuropathy. Stem Cell Res 35:101396 (2019).

8.

Dasgupta B; Rusha E; Drukker M. iPSC generation, prime to naïve reversion & characterization and primordial germ cell differentiation of Northern White Rhino. Univ Bremen : (2019).

9.

Su S; Guntur AR; Nguyen DC; Fakory SS; Doucette CC; Leech C; Lotana H; Kelley M; Kohil J; Martino J; Sims-Lucas S; Liaw L; Vary C; Rosen CJ; Brown AC. A Renewable Source of Human Beige Adipocytes for Development of Therapies to Treat Metabolic Syndrome. Cell Reports 25:3215-3228.e9 (2018).

10.

Klein T; Henkel L; Klug K; Kwok CK; Klopocki E; Üceyler N. Generation of the human induced pluripotent stem cell line UKWNLi002-A from dermal fibroblasts of a woman with a heterozygous c.608 C>T (p.Thr203Met) mutation in exon 3 of the nerve growth factor gene potentially associated with hereditary sensory and autonomic neuropathy type 5. Stem Cell Research

https://doi.org/10.1016/j.scr.2018.10.017 (2018)

11.

Liu X; Nefzger CM; Rossello FH; Chen J; Knaupp AS; Firas J; Ford E; Pflueger J; Paynter JM; Chy HS; O'Brien CM; Huang C; Mishra K; Hodgson-Garms M; Jansz N; Williams SM; Blewitt ME; Nilsson SK; Schittenhelm RL; Laslett AL; Lister R; Polo JM. Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming. Nature Methods 14:1055 (2017)


产品编号 产品名称 产品规格 产品等级
00-0076 StemRNA™-NM Reprogramming Kit
StemgentRNA™-NM重编程试剂盒		 1 kit －

隐身型RNA载体的研发及其在新一代细胞重编程技术中的应用

发表于由

隐身型RNA载体的研发及其在新一代细胞重编程技术中的应用

隐身型RNA载体的研发及其在新一代细胞重编程技术中的应用

常磐生物株式会社

中西真人

◆前言

      

通过导入基因实现的细胞重编程始于MyoD基因的发现，该基因可以将小鼠成纤维细胞（构成真皮等结缔组织的细胞）转化为肌肉细胞1）。然而，尽管许多研究人员辛勤耕耘，除了MyoD基因之外，并没有发现其他可以单独改变细胞特性的“主基因”。

2006年山中教授等人的研究表明，通过导入OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC四种基因，可以把组成外周组织的细胞重编程为人工诱导性多能干细胞（iPS细胞）2）。这一发现有力地表明了需要组合多种因子来诱导细胞重编程，为再生医学领域带来了重大转机。目前还有多份研究报告了通过组合多种因子从而使体细胞不经由iPS细胞，直接转化为其他体细胞的直接重编程（Direct reprogramming），以及通过强制表达外源基因来诱导iPS细胞分化的定向分化（Directed differentiation）也都成为了可能。

若要将通过细胞重编程制备的细胞应用于再生医学，需使用高性能的基因导入/表达载体。若要均等地诱导重编程，必须将多个基因高效导入细胞，以一定比例稳定表达1~3周后将其从细胞中完全去除，但是能够满足这些要求的技术有限。本文将阐述目前被认为适用于细胞重编程技术的隐身型RNA载体的研发背景及应用现状。

◆使用RNA病毒的基因导入/表达载体

随着1973年磷酸钙转染法的发现，将基因导入动物细胞的方法开始作为一种实用方法逐步应用于研究领域。此后，在1980年代又开发出了至今仍被广泛使用的逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒（AAV）载体等重组病毒载体，以及使用正电荷脂质和DNA复合物的脂质转染法（Lipofection）等非病毒载体的基因转染法，由此提升了人们对基因治疗的期待。

另一方面，没有DNA复制中间体的RNA病毒通常具有很强的细胞毒性，因此被认为不适合作为基因导入载体（逆转录病毒和慢病毒虽然也属于RNA病毒，但与其他RNA病毒的不同之处在于其RNA通过逆转录产生的基因组cDNA会先被插入宿主的基因组DNA中再进行转录）。例如，以仙台病毒（RNA病毒的一种）为基础的载体，可以非常强烈地诱导基因表达，但由于其细胞毒性，它并不适合长期持续的表达。

笔者历经30多年，研发出一种无需将基因插入动物细胞基因组DNA即可实现持续性基因表达的RNA载体。仙台病毒中存在一种可在37°C下引起持续感染的突变株，称为Clone 151（cl.151）株3,4）。笔者着眼于这种突变病毒，与分离出cl.151毒株的吉田哲也博士（现任广岛大学名誉教授）从1988年开始共同研究此毒株。当时，PCR法和DNA测序仪还没有普及，对具有约16 kb大基因组的仙台病毒变异株的研究寸步难行，于2007年报告分离了cl.151毒株全长基因组cDNA并分析了持续感染的机制5），并于2011年成功研发出SeVdp（缺陷型和持久型仙台病毒，Defective and persistent Sendai virus）载体，该载体缺乏自主复制能力，同时可搭载4个外源基因并稳定表达6）。

研究还发现，如果将OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC基因全部搭载至SeVdp载体，可高效重编程细胞，由此成功确立了使用持续表达型RNA病毒载体进行细胞重编程的原理。此外，还导入了一种在iPS细胞中特异性表达的miR-302自动清除载体基因组RNA的机制7），并在大量的实验室中应用于iPS细胞系的构建。

◆隐身型RNA载体的研发

通过对SeVdp载体的研究，揭示了使用RNA基因组实现稳定基因表达的必要条件。重要的是要避免干扰素诱导，在cl.151毒株中，编码RNA聚合酶的L基因突变会降低干扰素的诱导，与细胞毒性的降低有关5）。此外还发现，若编码构成病毒颗粒结构的M、F和HN基因全部缺失，不仅会降低细胞毒性，还可完全避免二次颗粒的产生6）。

另一方面，为推进将该载体应用于基因治疗和细胞重编程等领域，许多课题仍有待研究。例如，可在SeVdp载体搭载的基因结构有限，载体设计复杂，制造困难。此外，为了表达转录因子和各种受体，转录水平过高也是需要解决的问题。因此，从研发SeVdp载体的经验中吸取教训，我们着手研发更为通用的RNA载体，而研究的成果正是隐身型RNA载体（SRV）。

RNA病毒强烈诱导干扰素的原因之一在于病毒产生的RNA特性与动物细胞mRNA的特性显著不同，容易被识别为异物（病原体）。一般来说，RNA病毒的基因组RNA的GC含量较低，低于40%的不在少数。由于SeVdp载体的基因组RNA基本直接使用了天然存在的仙台病毒的遗传信息，其基因组RNA的GC含量约为46%，而人mRNA的GC含量约为60%。因为GC含量低的RNA会被细胞识别为异物8），所以我们决定通过优化密码子，使用人为增添过GC含量的RNA来重建载体。

曾有研究称在慢病毒等病毒载体中尝试了利用优化密码子来增加GC含量，但即使编码蛋白的一级结构相同，修饰后作为病毒的功能也会明显受损，因此认为病毒基因组RNA很难大规模地改变碱基序列。因此，笔者在研发SRV时，将非编码区替换为人mRNA来源的序列，同时仔细谨慎地对每个基因进行编码区优化，最终成功利用密码子优化了转录和复制所需的全部载体来源的基因。

此外，为需要搭载的基因设定了简易的规则，无论采用任何组合、顺序，都能以“转录盒”式连接法搭载至SRV中。上述改进的结果就是成功地制备出了在生理水平上表达基因的载体，同时可搭载的基因数量和大小多至10个（最长有14 kbp），大大超越了现有技术 , 可作为通用载体应用于各种目的9）。

◆可优化iPS细胞制备的隐身型RNA载体概述

SRV™ iPSC载体由常磐生物株式会社研发、富士胶片和光纯药销售，为了优化iPS细胞的制备，已采用了各种方法对其进行改进。例如，为尽可能地提高制备效率，根据作为重编程材料的细胞种类来改变载体的基因表达水平的同时，在适用于重编程血细胞的载体（SRV™ iPSC-2、SRV™ iPSC-4）中进一步改进并搭载了载体自动消除用的SeVdp-302L序列。此外，除了含有标准重编程基因组合（OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC）的4基因搭载型载体外，还设计了额外搭载有威斯康星大学的研究组曾报告过的NANOG和LIN28两种基因的6基因型载体，实现了超高效重编程。

隐身型RNA载体的研发及其在新一代细胞重编程技术中的应用

图１．SRV™ iPSC 载体的基因组结构

SRV ™ iPSC-2和SRV ™ iPSC-4具有响应miR-302后自动消除载体的系统。这种机制对于用血细胞生产iPS细胞非常有效。

此外，所有SRV ™ iPSC载体都带有发出绿色荧光的EGFP（增强型绿色荧光蛋白，Enhanced Green Fluorescent Protein）基因，作为基因表达的标志物，在重编程过程中可用荧光显微镜轻松监测基因表达（图2 )。

隐身型RNA载体的研发及其在新一代细胞重编程技术中的应用

图2. 使用SRV™ iPSC-2载体从外周血单细胞中构建iPS细胞

基因导入后第4天观察到EGFP荧光，证明该基因已被导入至几乎所有细胞中并已被表达。另一方面，在发生第一次传代前的第16天，已经出现了iPS细胞的集落，但几乎观察不到EGFP的荧光，由此可以确定载体已被自动消除。

根据以上改进，SRV™ iPSC载体实现了超越现有技术的重编程效率，即使是在Xeno-free、Feeder-free的严格要求下，也都能生产高质量的iPS细胞。特别是搭载有6因子的SRV ™ iPSC载体，对于需要高质量iPS细胞的再生医学来说是非常优秀的工具，并且针对自动制备iPS细胞等的应用仍在不断地改进。此外，只需改变搭载在SRV中的基因，即可兼容直接重编程（Direct reprogramming）、定向分化（Directed differentiation）等先进的细胞重编程技术，期待它能成为未来再生医学领域中被广泛使用的工具。

◆参考文献

 1）Davis, R. L. et al. : Cell, 51, 987 (1987). DOI: 10.1016/0092-8674(87)90585-x

 2）Takahashi, K. and Yamanaka, S. : Cell, 126, 663 (2006). DOI: 10.1016/j.cell.2006.07.024

 3）Yoshida, T. et al. : Virology, 92, 139 (1979). DOI: 10.1016/0042-6822(79)90220-4

 4）Yoshida, T. et al. : Virology, 120, 329 (1982). DOI: 10.1016/0042-6822(82)90034-4

 5）Nishimura, K. et al. : J. Biol. Chem., 282, 27383 (2007). DOI: 10.1074/jbc.M702028200

 6）Nishimura, K. et al. : J. Biol. Chem., 286, 4760 (2011). DOI: 10.1074/jbc.M110.183780

 7）Nishimura, K. et al. : Stem Cell Res., 23, 13 (2017). DOI: 10.1016/j.scr.2017.06.011

 8）Vabret, N. et al. : PLoS One, 7, e33502 (2012). DOI: 10.1371/journal.pone.0033502

 9）中西真人， 飯島実： 特許公報， 特許第6770224号

10）Yu, J. et al. : Science, 318, 1917 (2007). DOI: 10.1126/science.1151526

◆关键词

细胞重编程

血细胞和神经细胞都是由一个受精卵分裂且不可逆地分化细胞。由此，组成我们身体的细胞就具有了各种不同的功能和特性，一直以来人们都认为分化后的细胞其特性不会改变。然而MyoD基因的发现推翻了这一想法，揭示了分化细胞的特性可以人为改变。

 

持续感染

病毒与被感染的宿主细胞共存而不将宿主细胞杀死的一种感染状态。

 

诱导性多能干细胞（iPS细胞）

多能干细胞是指可分化成外胚层（皮肤和神经）、内胚层（消化道、肺、肝等）和中胚层（肌肉、血液等）的“多能性”细胞，在发现iPS细胞之前，更被人们熟知的是通过破坏人或动物发育过程中的胚胎而产生的胚胎干细胞（ES细胞）。然而ES细胞在破坏胚胎上存在伦理问题，若分化成ES细胞的细胞不使用免疫抑制剂就无法进行移植。另一方面，使用患者本人的细胞来制备iPS细胞，可在不发生免疫排斥的情况下进行移植，因此有望应用于再生医学。

点击此处查看相关产品：SRV™ Vector 系列