SeeDB

实现生物体样本深层成像

　　今井猛博士等人开发了一种对于水溶性生物体组织的形态和组成在不破坏荧光蛋白以及荧光神经示踪剂的条件下,可快捷简便地使大脑等生物体组织透明化的方法——SeeDB（See Deep Brain）。SeeDB 由水、果糖、还原剂构成。

　　SeeDB 法是在使用共聚焦显微镜和双光子激发显微镜下可深层成像的方法。可利用荧光蛋白和神经示踪剂，实现对荧光神经回路的全貌阐明和定量分析等各种各样的应用。

详细内容，请点击 SeeDB 技术开发者今井猛博士的网站：SeeDB Resources（本部分内容亦可参见相关资料）

◆SeeDB protocol 案例

　　SeeDB 法，可用于脊椎动物的各种组织，下面以小鼠大脑为例进行介绍。

１．固定

①将小鼠大脑在4%多聚甲醛/PBS，4℃下固定过夜。

②样本用PBS清洗三次（每次清洗10分钟）

２．透明化处理

③　将样品加入放有20 mL的SeeDB:20 w/v%果糖溶液的50 mL锥形瓶中。

　　在室温下在旋转器中旋转4-8小时（约4 rpm）

　　在脆弱的样本和薄片情况也可以用压板式摇床（约17 rpm）

④　将样本加入放有SeeDB:40 w/v%果糖溶液的50 mL锥形管中，室温下旋转4-8小时。

⑤　将样本加入放有SeeDB:60 w/v%果糖溶液的50 mL锥形管中，室温下旋转4-8小时。

⑥　将样本加入放有SeeDB:80 w/v%果糖溶液的50 mL锥形管中，室温下旋转12小时。

⑦　将样本加入放有SeeDB:100 w/v%果糖溶液的50 mL锥形管中，室温下旋转12小时。

⑧　将样本加入放有SeeDB的50 mL锥形管中，室温下旋转24小时。

   　最长时间可延长至48小时。在透明化成功时，透光可观察到组织透明化。

３．观察

⑨　将SeeDB处理过的大脑样本置于共聚焦显微镜或双光子激发显微镜下观察。

（注意点）

　　样本用SeeDB液固定。用SeeDB透明化处理后的样本折射率可达到1.49。因此，物镜中应该有甘油浸没透镜、油镜、透明化用镜片，即使浸水镜头到达2 mm深度也是没有问题的。浸没式镜片请使用浸没液，SeeDB不能用作浸没液。在使用干式镜头（折射率1.0）和浸水镜头（折射率1.33）获取画像情况下，需要补正深度值（补正值请参考相关文献）。

 

SeeDB　处理案例

SeeDB生物体样本透明化

左起依次为经SeeDB液透明化处理的小鼠幼胎（幼胎12天）

新生鼠（生后3天）的全脑、成鼠大脑（8周龄，厚度2 mm）

SeeDB　观察案例

双光子激发显微镜下的Thy1-YFP-H小鼠 （10周龄）大脑荧光成像 使用Olympus公司产品  多光子专用物镜：XLPLN10XSVMP观察案例	共聚焦显微镜下的Thy1-YFP-H小鼠 （10周龄）大脑荧光成像 使用Olympus公司产品 有机硅浸没式物镜：UPLSAPO 10X2观察案例

双光子激发显微镜下的Thy1-YFP-H小鼠

（10周龄）大脑荧光成像

使用Olimpus公司产品

多光子专用物镜：XLSLPLN25XGMP观察案例

比例尺：100 μm

小鼠大脑固定后用Dil标记，SeeDB透明化处理案例   

左：嗅球僧帽细胞树突（横向观察）

右：嗅球僧帽细胞树突（纵向观察）

使用Olympus公司产品

有机硅浸没型物镜：UPLSAPO 20X观察案例。比例尺：100 μm。

组织透明化配套耗材：成像用透明室

透明化试剂方法选择流程	SeeDB Protocol
组织透明试剂化系列

组织透明化试剂Q&A ver1.0

Tissue clearing reagent Q&A ver1.0

Q：组织透明化的原则

Ａ：组织透明化通常是按下面的步骤进行的：

Ａ（a）固定 （b）透化 （c）脱色 （d）折射率匹配

 

Q：组织透明化的优势

Ａ：目前大多数可用的透明化技术，都是通过编码荧光报告蛋白或者用荧光标记抗体进行后标记，从而可视化组织中特定的蛋白。组织透明化成为

Ａ：了具有单细胞分辨率的组织3D成像中重要的一环。

 

Q：透明化技术的比较

Ａ：下面是水性的透明化技术。

Ａ：SeeDB（基于果糖的方法）在一些应用中有一定优势。因为SeeDB不含去垢剂，所以对于透明化 DiI（细胞膜红色荧光探针，一种神经示踪剂）标记的样品和使用光电关联显微镜（CLEM）的情况下，SeeDB 有着一定优势。另外 SeeDB 会产生自体荧光，有时候会对辨认未标记的神经元结构（如神经毡）起着一定帮助。

Ａ：SeeDB2 是为使用高 NA 物镜的高分辨率成像而优化的技术；因此，当处理较大的组织时，CLARITY 或者 CUBIC 会是更好的选择。

 

Q：切片厚度的最大值和最小值？

Ａ：您应该根据您的物镜的 WD（工作距离）来决定切片的厚度。我们建议切片的厚度不要超过 3 mm。对于十分薄且脆弱的样品，我们建议使用

       琼脂糖包埋。使用 CUBIC，可以让全器官、全身透明化和使用 LSFM 的快速 3D 成像具有可重复性。

 

Q：试剂盒成分

Ａ：具体如下：

Ａ：1. SCALEVIEW-S试剂盒（299-79001）适用于20份1-2 mm的切片样品

Ａ：Ａ：1）　SCALEVIEW-S0——100 mL

Ａ：Ａ：2）　SCALEVIEW-S1——100 mL

Ａ：Ａ：3）　SCALEVIEW-S2——100 mL

Ａ：Ａ：4）　SCALEVIEW-S3——100 mL

Ａ：Ａ：5）　SCALEVIEW-S4——100 mL

Ａ：Ａ：6）　SCALEVIEW-SMT——100 mL

 

Ａ：2. SCALEVIEW-S试剂盒（290-80801）适用于20-30份1-2 mm的切片样品。

Ａ：Ａ：1）　SCaleCUBIC-1 Solution——250 mL

Ａ：Ａ：2）　SCaleCUBIC-2 Solution——250 mL

Ａ：Ａ：3）　Mounting Solution 1——40 mL

Ａ：Ａ：4）　Mounting Solution 2——40 mL

 

Ａ：3. SeeDB试剂盒（299-79901）适用于20-30份1-2 mm的切片样品。

Ａ：Ａ：1）　SeeDB：20w/v% Fructose Solution——50 mL

Ａ：Ａ：2）　SeeDB：40w/v% Fructose Solution——50 mL

Ａ：Ａ：3）　SeeDB：60w/v% Fructose Solution——50 mL

Ａ：Ａ：4）　SeeDB：80w/v% Fructose Solution——50 mL

Ａ：Ａ：5）　SeeDB：100w/v% Fructose Solution——50 mL

Ａ：Ａ：6）　SeeDB——50 mL

 

Ａ：4. SeeDB2试剂盒（294-80701）适用于20-30份1-2 mm的切片样品。

Ａ：Ａ：1）　Saponin（皂角苷）——5 g

Ａ：Ａ：2）　SeeDB2G solution——50 mL

Ａ：Ａ：3）　SeeDB2S solution——50 mL

Ａ：Ａ：4）　PBS——50 mL

 

Q：样品的保存

Ａ：SCALEVIEW-S处理的样品应在室温下保存2至3周。您可以在2至3周内观察SCALEVIEW-S透明化的样品中的荧光信号。

Ａ：CUBIC处理的样品应在室温下保存1周。您可以在1周内观察CUBIC透明化的样品中的荧光信号。

Ａ：SeeDB2G处理的样品应在冰箱中保存1年，而SeeDB2S处理的样品则可在室温下保存1年。您可以在1年内观察SeeDB透明化的样品中的

       荧光信号。

 

Q：抗体的荧光标记

Ａ：应在进行透明化前就进行抗体的荧光标记。

 

Q：适用于SCALEVIEW-S的显微镜

Ａ：SD-OSR（Olympus）

Ａ：FV-OSR（Olympus）

 

Q：适用于CUBIC的显微镜

Ａ：SD-OSR（Olympus）

Ａ：FV-OSR（Olympus）

Ａ：Zeiss Lightsheet Z.1（Carl Zeiss）

 

Q：适用于SeeDB2的显微镜

Ａ：Confocal（最好使用高NA的油浸镜头）

Ａ：STED（Leica Microsystems）

Ａ：SR-SIM（Carl Zeiss）

Ａ：SD-OSR（Olympus）

Ａ：FV-OSR（Olympus）

Ａ：Airyscan（Carl Zeiss）

Ａ：HyVolution（Leica Microsystems）

Ａ：Two-photon（最好使用复合浸没镜头）

Ａ：Confocal（最好使用高NA的甘油浸镜头）

Ａ：Light-sheet DLS（Leica，最好使用定制镜面的设备）

 

Q：重构

Ａ：对于定量用途，我们建议使用Neurolucida系统（MBF）。我们同样测试了VAST Lite用于成像用途时的表现。重构时也可以使用开源软件。

       例如，Vaa3d可以处理大量的拼接图像的数据。

 

Q：物镜推荐

 

Q：其他物种？其他器官？

Ａ：对于昆虫样品和鱼类样品，建议选择CUBIC。

Ａ：昆虫相关文献：Ohuma.et al.: Fish Pathology, 52(2), 96(2017).

Ａ：鱼类相关文献：Konno and S.Okazaki .: Zoological Letters, 4:13(2018).

   

　　对于多细胞球状体，选择SCALEVIEW-S会更好。

　　https://www.nature.com/articles/s41598-018-29169-0

 

参考文献

[1]　Ke, M. T., Fujimoto, S. and Imai, T. : Nat Neurosci ,6 (8),1154 (2013).

[2]　Ke, M. T., Fujimoto, S. and Imai, T.: Bio-protocol ,4(3), e1042 (2014).

[3]　Ke, M. T., and Imai, T. : Curr Protoc Neurosci ,66, 2.22.1-2.22.19 (2014).