Q&A
Ｑ： DsDD cDNA Subtraction Kit做什么的试剂盒？
Ａ： 将需要做比较的cDNA库用PCR进行扩增制备Tester和Driver cDNA，对DNA扩增产物进行削减的试剂盒。与传统方法相比，操作更简便，实
验时间也仅需2天时间。可以将现有的cDNA库或市面售卖的cDNA库直接开始进行实验，这是传统方法所不能做到的。而且最终制备出来的
Subtraction cDNA是混入管家基因较少的cDNA，可以直接应用于各种用途。
Ｑ： DsDD cDNA Subtraction Kit有什么优点？
Ａ：● 直接使用现有的cDNA，全部工序完成仅需2天。
Ａ：● 全程在DNA状态下进行，无需熟练的操作技术。cDNA的制备有非常高的选择性。
Ａ：● 可以通过市面或用户自己准备的质粒cDNA来制备。
Ａ：● 除了质粒以外，还可以从5’和3’端带接头的cDNA制备cDNA。
Ａ：● 操作简便
Ａ：● 最终制备出来的Subtraction cDNA反映最初所用的Tester cDNA。因为Tester没有经过限制性内切酶处理，所以一开始的Tester cDNA可
以反映最终制备的Subtraction cDNA的状态。原理上，在载体库使用全长cDNA，就能反映Subtraction cDNA的全长。
Ａ：● 只要改变Tester和Driver，就能进行反向削减。
Ａ：● 制备的Subtraction cDNA可以立刻应用于各种用途。
Ａ：● 制备的Subtraction cDNA中，混入管家基因的量少，所以它还可以作为载体亚克隆（系统序列）和DNA芯片的探针使用。
Ｑ： 与PCR-Select法有什么不同？
Ａ：
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起始材料
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接头添加
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杂交次数
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house-keeping基因污染
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DsDD法
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cDNA库或5’和3’末端带接头的cDNA
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不必要
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1次
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已经分解去除，污染小
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PCR-Select法
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RNA
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必要
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2次
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未经分解去除，有污染的可能性
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● PCR-Select法每次都需要通过RNA制备cDNA，DsDD法则只需cDNA库就能进行实验。另外，采用PCR-Select法必须用Rsal（4碱基内切酶）
酶切，将低分子化的接头分子与3’或5’端结合。而DsDD不需要。因此最终的Subtraction cDNA能反映最初的Tester cDNA的状态。
● PCR-Select法需要进行两次杂交，而DsDD法只需一次。
● PCR-Select法需要从大量cDNA样品中用Supression-PCR对SubtactedcDNA进行特异性扩增，而DsDD法则是通过对与管家基因等共同表达
的基因进行杂交后，用分解去除的方式，极力减少管家基因的污染。DsDD法的原理上是形成Subtraction cDNA群，因此可以直接应用于克
隆和DNA芯片的制作。
Ｑ： 操作DsDD法时，特别需要注意的事项是什么？
Ａ：1. 使用Tester，运用单向插入的cDNA库。
Tester的cDNA库，必须对载体使用单向插入的cDNA库。若不用单向cDNA库，即使是用λ核酸外切酶处理成单链，有意链和反意链的
cDNA会混为一体，Tester聚集杂交，是降低Subtraction效率的主要原因。
Ａ：2. 使用去除低分子DNA的色谱柱
DSN(Duplex-specific nuclease)是8bp以上的完全一致的双链DNA分解酶，因此其短断片残留多。在乙醇沉淀中，无法去除这些断片
或引物。引物残留的非特异性杂交，是DSN的非特异性分解的原因。DSN的分解产物在最后的PCR时，变成非特异性引物，是形成低分
子断片等非特异性断片增加的原因。
Ａ：3. 用乙醇共沉淀时，务必使用配套的Ethachinmate（乙醇沉淀核酸载体）
共沉淀时使用tRNA等核酸，会与Tester cDNA发生非特异性杂交。引起DSN的非特异性分解。
而Ethachinmate（乙醇沉淀核酸载体）是聚丙烯酰胺类的共沉淀剂，DNA回收率高达100%。即使通常不可见的沉淀也可以变为可见，
在操作移液器时避免误吸。
Ａ：4. 使用适用于1 μL的移液器。
Ａ ：1 μL的移液操作时，尽可能使用合适的吸移管操作（如Gilson公司的PIPETMAN 2P）。特别是在进行杂交时，Tester ssDNA和Driver
dsDNA需要注意移液操作。这一操作中，Tester：Driver=1：200这一比率的把握尤为重要，尽可能减小在移液移过程中的误差。
Ａ：5. 酶反应时使用PCR管。
说明书记载DNA扩增反应应尽可能使用PCR管。PCR热效率较好可以进行正确的反应。
Ｑ： 除试剂盒外还需准备什么？
Ａ：1. Tester和Driver扩增用的cDNA库
Ａ：2. Tester和Driver扩增用的Primer
Ａ：3. 参照基因扩增用Primer（GAPDH、β-Actin等）
Ａ：4. DNA聚合酶（TOPOTAQ DNA polymerase等）
Ａ：5. ｄNTP Mixture
Ａ：6. 低分子DNA和Primer去除用色谱柱
Ａ：7. 限定性酶
Ａ：8. 苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)
Ａ：9. 70％、99.5％乙醇
Ａ：10. DNA分子量marker
Ａ：11. 琼脂糖
Ａ：12. 溴化乙锭
Ａ：13. 1×TAE Buffer
Ａ：14. Loading Buffer
Ａ：15. 灭菌蒸馏水
Ｑ： DsDD是什么的缩写？
Ａ： DsDD是Duplex-specific Direct Digestion(双链特异性直接消化)的缩写。通过Duplex-specific DNA Nucelase，可以特异性切断杂交形
成的DNA群。
Ｑ： Tester和Driver是什么？
Ａ： 特异性表达的cDNA端叫“Tester”，作为基准的cDNA一般称为“Driver”。从癌特异性cDNA库制备的cDNA为“Tester”，正常细胞
来源的cDNA库配制的cDNA则为“Driver”。
Ｑ： 应选用何种凝胶过滤柱？
Ａ： 可以使用能去除100bp以下的，市面售卖的凝胶过滤柱。Code No.：195-14451 Spin Cleaner
Ｑ： 杂交一定要经过16小时么？
Ａ： 16~20小时都是没有问题的。建议16个小时是因为考虑到从实验当天17点开始进行杂交的话，第二天上午9点就可以进行下一项操作。
Ｑ： 按照protocol制备Driver ds cDNA，但还是不能配出200 ng/μL的浓度，应该如何解决？
Ａ： 浓度比较小的时候，请用乙醇共沉淀法操作。离心管中加入Tester 1 ng、Driver 200 ng后，加入无菌水100 μL，Ethachinmate 1μL，
3mol/L的Sodium Acetate 10 μL，乙醇250 μL，振荡混合后进行离心。然后去除上清，加入150 μL 70%的乙醇离心后，去除上清，干
燥，再加入3 μL的灭菌蒸馏水进行溶解。备用于杂交试验。
杂交操作中Tester：Driver=1:200的比率十分重要。乙醇沉淀导致部分DNA缺失是没有问题的。
Ｑ： DSN (Duplex-specific nuclease)有什么优点？
Ａ： DSN是堪察加蟹肝脏来源的新型双链特异性DNA分解酶，可在双链DNA或DNA-RNA杂交过程中特异性切断DNA。最适宜温度55~65℃，
Mg2+条件下，可用EDTA抑制其活性。因为DSN能在高温环境下进行反应，所以在DsDD法中，进行严格性较高的杂交反应。
Ｑ： 一定要使用PCR管吗？
Ａ： 说明书记载DNA扩增反应应尽可能使用PCR管。热效率较好能进行正确的反应。
Ｑ： Drive ds cDNA的限定性酶处理是必要的么？
Ａ： Tester和Driver的载体相同时，需要进行限定性酶处理。目的是防止因Primer结合引起非特异性杂交而导致DSN分解。用限定性酶只剪切
Tester和Driver的cDNA，相辅的cDNA杂交。通过改变Tester和Driver端的Primer set，进而减少非特异性杂交。
Ｑ： 扩增的Tester和Driver侧的Primer set可以是相同的吗？
Ａ： 同一Set也可以，但不是酶处理本身100%的反应。未处理的Driver cDNA Primer和Tester sscDNA的Primer结合，会通过DSN被分解。
为了防止上述情况，建议扩增Tester和Driver端的PrimerSet还是要区分开。
Ｑ： 限定性酶处理时如果出现Driver cDNA的内部被切断的话，会有影响吗？
Ａ： 没有影响。即使被切断了，还是能与Tester sscDNA进行杂交。
Ｑ： 一定要进行Exonuclease I处理吗？
Ａ： 不是必要的操作。对Subtraction cDNA使用标记探针时，Exonuclease I能分解Driver的cDNA，可降低背景。
Ｑ： 最后，扩增削减cDNA用到的Primer需要进行磷酸化吗？
Ａ： 不用，而是需要合成新的Primer。可以的话，建议使用最初的Primer内侧区域的Primer进行PCR操作。
Q: 配制Tester cDNA和Driver cDNA时使用的plasmid DNA会有影响吗？
Ａ： 没有影响的。DsDD法用的是双链特异性DNA分解酶（DSN），可分解plasmid DNA，所以不会影响。像生物素结合法、乳胶微粒oligo
(dT)固相法这些传统方法，无法去除plasmid DNA，才会对转换和探针的制备等产生影响。
Ｑ： 说明书推荐的TOPOTAQ DNA polymerase有什么特点？
Ａ： 本产品是Pyrococcus DNA polymerase和Taq DNA polymerase来源的催化结构域和甲烷细菌Methanopyruskandleri来源的非特异性
DNA结合域融合的新型耐热性DNA Polymarase。本酶家族带有拓朴异构酶活性。通过这个特性，仅通过酶反应就能扩增GC-rich领域。
这是目前其他酶都无法轻易做到的。TOPOTAQ DNA polymerase有热启动功能，能抑制非特异性的扩增。
Ｑ： Ethachinmate是什么？
Ａ： Ethachinmate由NipponGene生产的，在核酸（DNA或RNA）被乙醇或异丙醇沉淀时使用的高分子载体。使用本品，能从浓度低的核酸
溶液中定量回收微量核酸。加入乙醇或异丙醇后，无需进行-20℃或-80℃冷却，可直接离心。回收的核酸用缓冲液溶解后，可直接作为各
种酶的基质使用。
Ｑ： 去除的Subtracted cDNA有多大？
Ａ： 和光确认的大小为500~1500bp。最初用的cDNA库和DNA扩增的的延伸时间会影响Subtracted cDNA的大小。
Ｑ： Subtraction的效率是多少？
Ａ： Tester端用肝癌细胞HepG2来源的cDNA，Driver端用人正常肝脏组织由来cDNA的话，Real-time PCR过程中GAPDH会被抑制至1/1,000。
Ｑ： 对削减的基因进行亚克隆化，什么方法比较好？
Ａ： 一般采用的方法是：TA克隆或限定性酶处理后，插入目的载体，进行转换。
Ｑ： 证明cDNA削减的方法是什么？
Ａ： 配制的Subtracted cDNA经过TA克隆后，在菌落PCR确认插入断片，接合探针，通过其在市面售卖的mRNA点膜上的斑点，判断是否有组
织特异性基因存在的。还可以在数据库搜索序列，或解析DNA芯片的方法。
