产品信息

• 产品组分信息

  本产品提供以下试剂或组分：

  NEB #	名称	组分货号	储存温度	数量	浓度
  M0201V     -20       T4 Polynucleotide Kinase M0201VVIAL -20 1 x 0.025 ml 10,000 units/ml   T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer B0201SVIAL -20 1 x 1 ml 10 X
  M0201S     -20       T4 Polynucleotide Kinase M0201SVIAL -20 1 x 0.05 ml 10,000 units/ml   T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer B0201SVIAL -20 1 x 1 ml 10 X
  M0201L     -20       T4 Polynucleotide Kinase M0201LVIAL -20 1 x 0.25 ml 10,000 units/ml   T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer B0201SVIAL -20 1 x 1 ml 10 X

• 特性和用法

  单位定义

  1 单位即 1 Richardson 单位，指在 50 μl 总反应体系，含有 66 µM [γ-³²P] ATP（5 x 10⁶ cpm/µmol）和 0.26 mM 5´ 羟基末端鲑鱼精子 DNA 的 1X T4 多聚核苷酸激酶反应缓冲液中，37℃ 条件下，30 分钟内催化 1 nmol [³²P] 掺入酸不溶物所需的酶量（1）。

  反应条件

  1X T4 多聚核苷酸激酶反应缓冲液
  Incubate at 37°C

  1X T4 多聚核苷酸激酶反应缓冲液
  70 mM Tris-HCl
  10 mM MgCl₂
  5 mM DTT
  (pH 7.6 @ 25°C)

  使用浓度

  10,000 units/ml

  贮存溶液

  10 mM Tris-HCl
  50 mM KCl
  1 mM DTT
  0.1 mM EDTA
  50% Glycerol
  0.1 µM ATP
  pH 7.4 @ 25°C

  热失活

  65°C for 20 minutes

• 优势和特性

  应用特性

  • DNA 或 RNA 的末端标记，用作探针和进行 DNA 测序（2）
  • 在寡核苷酸上添加 5´ 磷酸，以便进行后续连接
  • 除去 3´ 磷酸基团（3）

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  单独销售的组分

  • T4 多聚核苷酸激酶反应缓冲液

• 注意事项

  1. 提高 ATP 的浓度可让缺口磷酸化。切刻位点不能有效地磷酸化。CTP、GTP、TTP、UTP、dATP 及 dTTP 均可以替代 ATP 作为磷酸供体（1）。
  2. 利用交换反应可以避免末端标记前的去磷酸化，尽管这会导致较低的标记比活性。
  3. 在反应体系中添加终浓度为 100 µM ADP 便仍可保持足够的掺入水平。要达到更高的掺入水平，请使用参考文献（2）中所描述的缓冲液。

• 参考文献

  1. Richardson, CC. (1981). The Enzyme. 14, 299-314.
  2. Sambrook, J. et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual.. 10.59-10.67,11.31-11.33.
  3. Cameron, V. and Uhlenbeck, O.C. (1977). Biochemistry. 16, 5120-5126.
  4. Berkner, K.L. and Folk, W.R. (1977). J. Biol. Chem.,. 252, 3176-3184.
  5. Soltis, D.A. and Uhlenbeck, 0.C. (1982). J. Biol. Chem.. 257, 11332-11339.
  6. Wang, L.K. and Human, S. (2001). J. Biol. Chem.. 276, 26868-26874.
  7. Wang, L.K. and Shuman, S. (2002). Nucl. Acids Res.. 30, 1073-1080.
  8. Vance, J.R. and Wilson, T.E. (2001). Mol. Cell. Biol. 21, 7191-7198.
  9. Interthal, H. et al. (2005). J. Biol. Chem.,. 280, 36518-36528.

操作说明、说明书 & 用法

• 操作说明

  1. Radioactive Labeling with T4 PNK or T4 PNK (3´ phosphatase minus)
  2. Non-radioactive Phosphorylation with T4 PNK or T4 PNK (3´ phosphatase minus)
  3. End-labeling Protocol

• 使用指南

  • Activity of DNA Modifying Enzymes in rCutSmart™ Buffer

工具 & 资源

• 选择指南

  • NEB Diluent and Buffer Table

• Web 工具

  • NEBcloner^®

FAQs & 问题解决指南

• FAQs

  1. What factors can cause incomplete phosphorylation when using T4 Polynucleotide Kinase?
  2. Can I use T4 Polynucleotide Kinase and T4 DNA Ligase in the same reaction buffer?
  3. How can the rate of phosphorylation be improved when using T4 Polynucleotide Kinase?
  4. Do I need to dephosphorylate prior to labeling?
  5. How much substrate can be phosphorylated in a standard reaction?
  6. How many units of T4 Polynucleotide Kinase should be used for a typical reaction?
  7. How do I inactivate the enzyme?
  8. How to calculate the molarity of ends?
  9. What labels can be used?
  10. Will T4 Polynucleotide Kinase work in rCutSmart Buffer?