VA-044

用于脂质提取的聚合物引发剂

　　一个世纪以来，生物学家们一直梦想着能够透过器官甚至整个机体，亲眼看到细胞连接和精细结构，现在随着组织透明化技术的完善，这一梦想终于成为了现实。

◆原理

VA-044 作为组织透明化技术中起关键作用的水溶性偶氮引发剂，普遍适用于高分子合成的水溶液聚合与乳液聚合。在 CLARITY 方法中，VA-044 作为引发剂，催化丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺和 PFA 形成水凝胶。

2013 年3 月，斯坦福大学的 Karl Deisseroth 博士领导的团队在自然杂志（Nature）上发表了 Structural and molecularinterrogation of intact biological systems 的论文，文中介绍了制备组织的方法 CLARITY。该方法是将组织浸透在水凝胶单体溶液中（Hydrogel Monomer Solution）中，经电泳使组织呈现透明。这种水溶胶—组织杂交的方式可以维持组织的原有结构，使生物分子结合到水凝胶的网孔上。重要的是脂类不会结合到水凝胶上，因而可以通过这种方式将脂类有效去除。通过这种方法制备的组织样品可用于后期的影像实验，免疫染色，原位杂交等实验。

　　CLARITY 可用于荧光蛋白质和抗体的免疫染色，可作为解析脑神经回路的有效工具。VA-044 是论文实验步骤中透明化工程的使用试剂。

◆特点• 优势

●   操作简单，固定蛋白后只需进行电泳；

●    可保持组织、器官和全身结构的完整性；

●    可进行原位杂交和免疫组化实验，可进行多轮染色和脱色步骤；

◆案例•应用

Clarity 介绍

PARS 介绍

2014 年7 月，加州理工学院的研究团队在细胞杂志（Cell）上发表论文 Single-Cell Phenotyping within TransparentIntact Tissue through Whole-Body Clearing，将 CLARITY 技术推进到一个新的高度——全身组织透明化技术，称为 PARS（Perfusion-assisted Agent Release in Situ）。这种技术将透明剂持续泵入动物的循环系统从而进入各个组织，或者通过脑脊液管道泵入大脑，再去除脂质，使器官和生物体被高分子渗透而呈现透明，并可用荧光抗体分析和揭示具有完整连接性的细胞结构和三维细胞排列。

图Ａ．PARS 建立的小鼠透明化肠，并用凝集素（lectin） 亚甲基蓝（methylene blue）、DAPI 进行免疫标记后成像  并获得三种免疫标记的叠加图（merge）	图Ｂ．PARS 建立的小鼠透明化肾脏并用抗微管蛋白抗体 和 DRAQ5 进行免疫标记后成像，并获得两种免疫 标记的叠加图

CLARITY 处理的小鼠脑

 

CLARITY 处理的小鼠大脑成像

CLARITY 处理的 Thy1-YFP（H Line）小鼠大脑的荧光观察
（A）从大脑皮质到海马的３-D观察图像
    （B）大脑皮层Ⅴ层的锥体细胞的树突图像
拍摄条件：双光子   使用设备：Olympus FV1000 直立显微镜，25 倍浸液物镜

 

CLARITY+抗体处理的小鼠大脑成像

CLARITY 处理后，用 Iba1抗体染色 Thy1-YFP（Ｈ线）小鼠大脑的荧光观察
　　　　　（A）在大脑皮质的小胶质细胞的３-D观察图像
（B）从表面层观察皮质Ⅰ层的图像
拍摄条件：单光子   使用设备：Olympus FV1000 直立显微镜，25 倍浸液物镜

请点击图片观看视频

组织透明化辅助试剂

脂质除去用电泳槽

◆相关资料

VA-044(聚合物引发剂）	CLARITY电泳仪器	CLARITY_Protocol
文献验证可与FUJIFILM Wako透明化试剂配合使用的抗体列表	组织透明试剂化系列

◆相关产品

制造商	产品编号	产品名称	中文名称	包装
NIHON EIDO	631-26271	Electrophoresis Chamber For Lipid Extraction	脂质去除用电泳槽	一台

CLARITY 步骤

水凝胶单体溶液组成

●　VA-044············         1 g
●　40％的丙烯酰胺······ 40 mL
●　２％双丙烯酰胺·····  10 mL
●　10×PBS···········        40 mL
●　16％多聚甲醛·····    100 mL

●　皂素···········             200 mL

●　水·············               210 mL

电泳缓冲液

●　硼酸…       123.66 g
●　SDS····       400 g
●　NaOH···    调制至 pH8.5

●　水·····         定容至10 L

●　Electrophoresis Chamber For Lipid Extraction

循环泵

●　GPU-1，GPU-2（AS 版）

CLARITY 试剂列表

产品编号	产品名称	中文名称	规格	包装
017-08012	Acrylamide	丙烯酰胺	电泳用	25 g
019-08011				100 g
011-08015				500 g
138-06032	N,N'-Methylenebis(acrylamide)	N,N'-亚甲基双(丙烯酰胺)	电泳用	25 g
130-06031				100 g
163-25265	10×PBS(-)	磷酸缓冲液	细胞培养用	500 mL
160-16061	Paraformaldehyde	多聚甲醛	组织固定用	100 g
162-16065				500 g
163-25983	16w/v% Paraformaldehyde   Solution, Methanol free	16w/v% 低聚甲醛溶液	电子显微镜用	10 mL×10A
198-08853	Saponin, from Soybeans	皂素	和光一级	1 g
192-08851				5 g
029-02191	Boric Acid	硼酸	试剂特级	100 g
021-02195				500 g
023-02194				4 kg
190-13982	Sodium Dodecyl   Sulfate	十二烷基硫酸钠	分子生物学用	25 g
192-13981				100 g
194-13985				500 g

参考文献

[1]  Chung K. et al. :Nature., 497, 332（2013）.

[2]   Yang B.et al.:Cell., 158:1-14（2014）.

[3]  Yang et al., Single-Cell Phenotyping within Transparent Intact Tissue through Whole-Body Clearing, Cell(2014).<全文>

[4]  Susaki et al., Whole-Brain Imaging with Single-Cell Resolution Using Chemical Cocktails and Computational Analysis[J].Cell (2014),<全文>
[5]  Kwanghun Chung, JenelleWallace, Sung-Yon Kim,et al.Structural andmolecular interrogation of intact biological systems[J].NATURE,2013.<全文>