质谱级赖氨酰肽链内切酶

Lysyl Endopeptidase^®

　　本产品是质谱分析前处理时常用的蛋白分解酶即赖氨酰肽链内切酶，该酶可以特异性切除赖氨酸基团C末端的多肽，可用于蛋白测序分析和 Lys-X 化合物的酶合成。若同时使用赖氨酰肽链内切酶和胰酶，可更好地切断赖氨酸基团的多肽，增加多肽的数量。产品已按照使用习惯做成小包装，是方便使用的冷冻干燥品。20 μg/支可用于100-200个样品的凝胶内消化。

来源：细菌

外观：冻干粉（包含２ mmol/L Tris-HCl 缓冲液，pH８）

活性：0.03～0.07 AU/vial

分子量：27,000（琼脂糖过滤），30,000（SDS-PAGE）

溶解性：溶于水或缓冲液

稳定性：溶解于 pH 值 5.0-12.0 的 Tris 缓冲液中，可在４℃稳定保存２年；在 pH 值 6.0-11.0、30℃时能稳定保存，但温度超过50℃时不稳定。

最适pH值：9.0~9.5

等电点：6.9~7.0 

底物特异性：

可水解底物——Tos-Lys-OMe、Bz-Lys-NH₂、Bz-Lys-pNA、Lys-pNA

不可水解底物——Bz-Arg-NH₂、Bz-Arg-pNA、Arg-pNA

抑制剂：DFP、PMSF、TLCK

◆特点

●  高特异性、高蛋白质消化率、适用于蛋白质谱分析

●  提高裂解效率、增加肽段数量

●  根据使用量特意制备小包装，方便使用

◆应用

　　分别采用胰蛋白酶（Tp）、赖氨酰肽链内切酶（Lys-C）和 Tp与Lys-C 联用进行胶内酶切的效果比较。

　　牛血清蛋白 BSA 的条带（100 ng）通过 SDS-PAGE 获得，然后分别用 Tp、Lys-C 和 Lys-C+Tp 进行酶切，再用 MALDI-TOFMS 法进行分析。

　　这些蛋白酶的实验效果见下表。

表 1：Tp、Lys-C 和 Lys-C+Tp 的结果对照

这些结果表明 Lys-C 酶解的错误裂解率最低。Tp 酶解时加入 Lys-C 后，错误裂解率有所降低，同时，可以鉴定出更多的多肽。

	Tp	Lys-C	Lys-C+Tp
裂解位点	精氨酸和赖氨酸的Ｃ端	赖氨酸的Ｃ端	精氨酸和赖氨酸的Ｃ端
错误裂解率 (错误裂解所占比例  )	多（８%）	很少（０%）	少（３%）
鉴定出的多肽数量	１７	１９	２２

胰蛋白酶（Tp）（图 ａ）和赖氨酰肽链内切酶（Lys-C）+Tp（ 图 ｂ）酶切后的质谱结果对照图。

Lys-C+Tp 酶切后，可以在 m/z=2000 时得到吸收峰，而单独的 Tp 酶切在 m/z=2000 时没有吸收峰。该结果表明 Lys-C 可以提高测序覆盖度。

 

( 数据由大阪医疗中心和妇婴健康研究所Ｙ. Wada 博士提供 )

赖氨酰肽链内切酶

　　赖氨酰肽链内切酶，最初由 Masaki 等人从土壤细菌中分离得到。该酶可以特异性剪切赖氨酸残基Ｃ末端和Ｓ-氨乙基半胱氨酸残基的肽键，用于蛋白测序和 Lys-X 化合物的酶催化合成。该酶稳定性高，在４Ｍ尿素或 0.1% SDS 溶液中 30℃ 孵育６小时之后，仍然拥有完整的生物活性。

外观	冻干粉（包含ca. 10% Tris-HCl buffer，pH 8）	活性	见包装
分子量	27,000（凝胶过滤）；30,000 (SDS-PAGE)	溶解性	易溶于水或缓冲液
最佳pH	9.0-9.5（酰胺酶的最佳活性 pH）	等电点	6.9-7.0
抑制剂	DFP、PMSF、TLCK	来源	细菌
稳定性	溶于pH 值 5.0-12.0 的缓冲液中，可于４℃稳定保存。溶于pH 值 6.0-11.0 的缓冲液中，可于30℃稳 　定保存，但是50℃及以上不稳定。
单位定义	一单位酰胺酶（AU）指在30℃ pH 9.5 时每分钟产生１ μmol 对硝基苯胺所需的酶量。
底物特异性	水解底物：Tos-Lys-Ome、Bz-Lys-NH2、Bz-Lys-pNA、Lys-pNA
	非水解底物：Bz-Arg-NH2、Bz-Arg-pNa、Arg-pNA

实验方法

1. 试剂：

A．0.2 mol/L AMP 缓冲液，pH值 9.5

      溶解 4.2 g 的２-氨基-２-甲基-１,３-丙二醇于 150 mL 的水中，加入1 mol/L HCl 调 pH 值至 9.5，再加水使体积至 200 mL。

B．2.5 mmol/L 底物溶液

      溶解 22.6 mg 的Ｎ-苯甲酰基-ＤＬ-精氨酰-４-硝基苯胺盐酸盐于 20 mL 水中。

C.   2 mmol/L Tris-HCl 缓冲液，pH８

      溶解 0.24 mg的２-氨基-２-羟甲基-１,３-丙二醇于 900 mL 水中，加入 0.1 mol/L HCl 调pH值至8，再加水使体积至１ L。

D.   酶溶液

      溶解１vial 的赖氨酰肽链内切酶于１mL 的溶剂Ｃ中，可直接加入。

E． 终止溶液

      将 55 mL 水和 45 mL 乙酸混合均匀。

 

2. 步骤

试剂	检测样品	空白对照
A	2.6 mL	2.6 mL
B	0.3 mL	0.3 mL
	30℃ 预培养5分钟
D	0.1 mL	–
C	–	0.1 mL
	立即混合均匀，30℃ 预培养25分钟
E	1.0 mL	1.0 mL

 

3. 单位的定义

酰胺酶单位是指 30℃、pH 9.5 时，每分钟产生１μmol 对硝基苯胺的酶量。

 

AU/vial = [(a-b) / 25] × (1/9.62) × (4.0/0.1)

a.    检测样品中的吸光度

b.    空白对照中的吸光度

 

胶内酶切的实验操作流程

　　用聚硅酮处理的微量离心管和吸管端防止捕获任何蛋白。使用质谱分析用凝胶染色试剂盒，例如银染剂 MS 试剂盒（产品编号：299-58901）和负凝胶染色 MS 试剂盒（产品编号：293-57701）

1.    电泳分离蛋白质样品；

2.    从凝胶中切割蛋白质片断并放入微量离心管；

3.    使凝胶脱色（可使用质谱分析用凝胶染色试剂盒中的脱色溶液）；

4.    加入300 μL 乙腈到试管里，搅拌器振荡 30 分钟；

5.    去除乙腈，用 Parafilm 膜覆盖微量离心管。

6.    在 Parafilm 膜上打出针孔，真空干燥 15 分钟；

7.    100 μL 10 mmol/L DTT 溶解于 100 mmol/L 碳酸氢铵，56℃恒温１小时。

8.    室温冷却后，用等量的 50 mM 碘乙酰胺溶解于 100 mmol/L 碳酸氢铵，暗处恒温 45 分钟并涡旋；

9.    用 100 μL 100 mmol/L 碳酸氢铵洗涤凝胶片段 10 分钟；

10.  用 300 μL 乙腈干燥凝胶片段 15 分钟；

11.  用 100 μL 100 mmol/L 碳酸氢铵溶胀凝胶片段 15 分钟；

12.  用 300 μL 乙腈再次干燥凝胶片段 15 分钟；

13.  去除液相，真空干燥凝胶片段 15 分钟；

14.  用 100 μL 赖氨酸内切酶溶液*在冰水浴中溶胀凝胶片段 45 分钟；

　　*赖氨酸内切酶稀释于 50 mmol/L Tris-HCl  pH 8.5；

15.  去除 100 μL 赖氨酸内切酶溶液，将凝胶片段放在 37℃、10 μL 50 mmol/L Tris-HCl pH 8.5 中过夜；

16.  加入 50 μL 20mmol/L 碳酸氢铵 20 分钟内振荡凝胶片段３次抽提多肽；

17.  加入 5% 甲酸/50% 乙腈 20 分钟内振荡凝胶片段３次抽提多肽；

18.  如果需要用 Speed Vac. 浓缩多肽；

19.  用 ZipTip 脱盐和纯化多肽；

20.  如果需要用弱真空浓缩多肽至２ μL；

21.  加入基质进行质谱分析。

 

注意：根据细菌的生理和形态特征分类，产品来源为水解无色杆菌，但是最近细菌分类学将这种细菌鉴定为产酶溶杆菌。

保存：暗处－20℃保存

 

规格：20 μg×5 vial

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产品编号	产品名称	包装	应用
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050-05941	Endoproteinase Glu-C, Sequencing grade 胞内蛋白酶 Glu-C（测序级别）	50 μg
164-13982	V8 Protease [Endoproteinase Glu-C] V8蛋白酶	2 mg	生物化学

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赖氨酰肽链内切酶，MS级

产品编号：125-05061

发表文献

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