SARS-CoV-2 E484K Mutation Detection Kit

SARS-CoV-2 E484K 突变检测试剂盒

◆试剂盒组成

20 Reactions
RT酶混合物（20×）	20 µL x 1支
一步反应混合物（2×）	200 μL x 1支
484E Wild Type Primer & Probe   Mixture（probe：FAM） 484E野生型引物＆探针混合物（探针：FAM）	10 µL x 1支
E484K Mutant Type Primer & Probe   Mixture（probe：FAM） E484K突变型引物＆探针混合物（探针：FAM）	10 µL x 1支

200 Reactions
RT酶混合物（20×）	200 µL x 1支
一步反应混合物（2×）	1 mL x 2支
484E Wild Type Primer & Probe   Mixture（probe：FAM） 484E野生型引物＆探针混合物（探针：FAM）	100 µL x 1支
E484K Mutant Type Primer & Probe   Mixture（probe：FAM） E484K突变型引物＆探针混合物（探针：FAM）	100 µL x 1支

◆背景

新冠病毒突变株在世界范围内不断扩散，感染人数也在不断增多。

有报告指出，新冠病毒Beta（B.1.351）突变株和Gamma（P.1）突变株含有的E484K突变或会逃避免疫，使疫苗的效果降低^1-3）。

※ Beta（B.1.351）突变株：在南非首次发现的突变株

※ Gamma（P.1）突变株：在巴西首次发现的突变株

 

通过FUJIFILM Wako开发的Primer设计技术，可以高灵敏检测难以被检测的基因点突变。本产品是快速简便检测E484K突变的试剂盒。

◆特点

● 判定容易

通过比较使用突变株与野生株Primer/Probe Set时的Ct值来判定

● 一步法RT-qPCR快速检测突变

约70 min即可完成

● 使用FUJIFILM Wako研发的Primer/Probe，高灵敏检测突变

● 所有突变株均可在相同的反应条件下检测

由于N501Y、E484K、L452R、E484Q的PCR反应条件均相同，可在同一个96孔板中进行检测。

 

 

◆检测原理

采用TaqMan^®探针的一步法RT-qPCR。

利用FUJIFILM Wako开发的Primer，高灵敏度检测点突变。

▼使用前

病毒RNA量较多情况下，在突变株中使用常规株（非突变）检测用“484E Wild type Primer & Probe Mixture”，也可以观察到扩增信号。请务必使用常规株（非突变）检测用的“484E Wild type Primer & Probe Mixture”和突变株检测用的“E484K Mutant Type Primer & Probe Mixture”两种试剂进行检测。

比较两个Ct值，若突变株检测用“E484K Mutant Type Primer & Probe Mixture”的Ct值小，则可判断病毒为E484K突变株。

◆突变株的检测应用数据

本试剂盒已经检出以下3种新冠病毒（SARS-CoV-2）株。

● Gamma株（P.1）突变株（TY7-501、E484K突变、N501Y突变，由日本国立感染症研究所提供）

● Beta株（B.1.351）突变株（TY8-612、E484K突变、N501Y突变，由日本国立感染症研究所提供）

● Alpha株（B.1.1.7）突变株（QHN001、E484K无突变、N501Y突变，由日本国立感染症研究所提供）

● VR-1986HK（E484K无突变、N501Y无突变、ATCC)

样品拷贝份数：5000、500、50 copies/Well

循环数：45

 

① gamma（P.1）株：TY7-501（E484K突变、N501Y突变）

	5000 copies	500 copies	50 copies
Gamma株 （含有E484K突变）

对于含有E484K突变的gamma株（P.1）突变株，使用突变株检测用的“E484K Mutant type Primer & Probe”，可以确认到扩增信号。

常规株（非突变）检测用的“484E Wild type Primer & Probe”，在5000 copies的条件下可以观察到扩增信号，但可以在更低Ct值下检测到突变株，由此判断为E484K突变株。在500 copies和50 copies的条件下，未能检测到常规株（非突变）的扩增信号。

② Beta株（B.1.351）：TY8-612（E484K突变、N501Y突变）

	5000 copies	500 copies	50 copies
Beta株 （含有E494K突变）

对于含有E484K突变的beta株（B.1351）突变株，使用突变株检测用的“E484K Mutant type Primer/Probe”，可以确认到扩增信号。

常规株（非突变）检测用的“484E Wild type Primer/Probe”，在5000 copies的条件下可观察到轻微的扩增信号，但可以在更低的Ct值下检测到突变株，由此判断为E484K突变株。在500 copies和50 copies的条件下，未能检测到常规株（非突变）的扩增信号。

③ Alpha株（B.1.1.7）：QHN001（E484K无突变、N501Y突变）

	5000 copies	500 copies	50 copies
alpha株 （含有E484K突变）

对于不含E484K突变的alpha株（B.1.1.7）突变株，利用常规株（非突变）检测用的“484E Wild type Primer＆Probe”，可以确认到扩增信号。

突变株检测用的“E484K Mutant type Primer＆Probe”，在5000copies的条件下可观察到扩增信号，但可以在更低的Ct值下检测到常规株（非突变），由此判断为常规株的突变株。在500 copies和50 copies的条件下，未能检测到突变株的扩增信号。

 

④ VR-1986HK（E484K无突变、N501Y无突变)

	5000 copies	500 copies	50 copies
无突变

对于不含N501Y突变和E484K突变的VR-1986HK，利用常规株（非突变）检测用的“484E Wild type Primer＆Probe”，可以确认到扩增信号。

关于突变株检测用的“E484K Mutant type Primer＆Probe”，在5000 copies的条件下可观察到扩增信号，但可以在更低的Ct值下检测到常规株（非突变），由此判断为常规株的突变株。在500 copies和50 copies的条件下，未能检测到突变株的扩增信号。

◆PCR反应条件

◆常规株以及突变株的基因型

FAQ

Q：能否判定新冠病毒阳性/阴性？

A：本试剂盒检测阳性样品中是否存在基因突变，无法判定阳性/阴性。

Q：能否检测用直接PCR法简单提取的RNA样品？

A：本试剂盒无法检测简单提取的RNA。请使用RNA提取/纯化试剂盒等生成的RNA。

      离心柱：ISOSPIN Viral RNA（产品编号： 310-08931, 日本基因）

      自动核酸提取仪：QuickGene-Auto 12S/24S（倉敷紡績，还需要QuickGene AutoS RNA Virus Kit）

Q：试剂盒包装“200 Reactions”是什么意思？

A：【200 Reactions】是指实时PCR可以分开200孔进行。1个样品需要2个孔，即100个样品。

 ①    含有常规株的Primer＆Probe的孔

 ②    含有突变株的Primer＆Probe的孔

Q：试剂盒中是否包含病毒的阳性对照RNA？

A：本试剂盒不含阳性对照。若有需要，请向FUJIFILM Wako客服咨询。

Q：当野生株和突变株的扩增曲线均起峰时，应如何判断？

A：如果病毒量高，无论是突变株样品，还是野生株，都有可能在其Primer＆Probe中观察到扩增信号。然而，在此情况下，突变株的扩增信号上升

      得更快（Ct值小）。请务必通过突变株和常规株用的两种Primer＆Probe进行检测，以确定 Ct 值的差异。

Q：是否存在E484K单独突变？

A：不含N501Y突变、但含E484K突变的E484K单独突变株，已被确认为R.1株。但目前的信息较少，日本国立传染病研究所认为它是需要关注的突

      变株（VOI），而不是高关注突变株（VOC）。

参考文献

1.	Nelson, G., Buzko, O., Spilman, P., Niazi, K., Rabizadeh, S., Soon-Shiong, P. : bioRxiv (2021). doi:https://doi.org/10.1101/2021.01.13.426558
2.	Jangra, S., Ye, C., Rathnasinghe, R., Stadlbauer, D., PVI study group, Krammer,F., Simon, V., Martinez-Sobrido, L., García-Sastre, A., Schotsaert, M. : medRxiv (2021). doi:https://doi.org/10.1101/2021.01.26.21250543
3.	Wang, Z. et al. : Nature (2021). doi:10.1038/s41586-021-03324-6