PA标签系统 重组蛋白纯化检测用

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PA标签系统 重组蛋白纯化检测用

重组蛋白纯化检测用

PA标签系统

PA标签系统 重组蛋白纯化检测用

PA标签系统 重组蛋白纯化检测用

◆特点


●　通过树脂再生，降低运行成本

●　超高亲和性抗体，实现高回收率、高纯度纯化

●　在动物细胞表达系（HEK293T细胞、CHO细胞等）中，有效纯化蛋白

●　PA标签系统是使用可识别肽标签（12个氨基酸残基）的单抗（NZ-1）。日本开发的亲和性纯化标签系统。

●　NZ-1单抗对PA tag具有高亲和性和特异性，可应用于Western Blotting、细胞流式分析、免疫组化（ICC）。

　  通过免疫沉淀，可纯化PA标签融合蛋白以及树脂再生。

●　PA标签系统，可一步纯化高纯度PA标签融合蛋白。

 


◆PA标签系统


　　Fujii, Y. et al., "PA tag: A versatile protein tagging system using a super high affi nity antibody against a dodecapeptide derived from human podoplanin.", Protein Exp. Purif., 95, 240-247(2014).



Fujii, Y. et al.


　　新型亲和标签系统“PA tag”的应用方法~蛋白的纯化及检测~

　　蛋白科学学会档案, 7, e075 (2014)



◆PA标签表达载体案例


PA标签系统 重组蛋白纯化检测用

 


载体

表达模式

宿主细胞

MCS启动子

pCAG

瞬时表达

灵长类（人、猴）、犬细胞等粘着细胞
  和啮齿动物细胞

CAG

和光还推出除上述抗性基因载体外的其他载体。（请点击参考。）

测序用引物序列、其他载体序列的相关详细信息，已附在产品现货说明书中。

另外可点击和光主页/TARGET标签，查看序列信息、Multi Cloning Site(MCS)信息。

◆用PA标签从培养上清中亲和提纯的案例


PA标签系统 重组蛋白纯化检测用

数据提供：大阪大学 蛋白研究所附属蛋白分析先进研究中心  

分子创制学研究室 高木淳一老师，藤井勇树老师

 


◆Protocol目的蛋白的纯化


１．哺乳类动物细胞转染(HEK293T)
　　转染处于40-60%融合状态的细胞
　　培养基：D-MEM, 5%FBS

２．回收培养上清和吸附蛋白树脂
　　转染48-72小时后，回收约420 mL培养上清，加入8 mL抗PA标签抗体琼脂糖珠，混合2小时（2-10℃）

３．树脂回收
　　用50 mL的纯化柱。回收步骤2)中的琼脂糖珠

４．树脂洗涤
　　加入珠4倍量的TBS 缓冲液（20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl），清洗5次

５．PA标签肽从树脂中竞争性洗脱
　　加入经1×TBS溶液, pH 7.5溶解过的PA 标签肽（终浓度0.1 mg/mL），体积量需为珠的一倍，

　　然后分10次回收PA标签融合蛋白X

６．SDS-PAGE
　　样品量
　　c. sup：5 μL, flow through：5 μL, wash：5 μL,
　　肽洗脱（1-10）：各10 μL

　　可纯化PA标签融合蛋白X且不依赖PA标签。→可实现极高纯度的亲和纯化。

 


◆通过PA tag降低背景的方法

PA标签系统 重组蛋白纯化检测用
                可在含有高浓度NaCl的TBS溶液中，通过前清洗去除杂质蛋白！！

M: Marker
I: input 100ng分
P: 纯化前样品
1: wash片段①
2: wash片段②
3: wash片段③
4: wash片段④
5: wash片段⑤
6: wash片段⑥
7: wash片段⑦
8: wash片段⑧
9: wash片段⑨
10: 酸洗脱①
11: 酸洗脱②
12: 酸洗脱③
13: 酸洗脱④
14: 酸洗脱⑤

 

　　在20 mL的昆虫细胞溶解液中加入蛋白Z，使其浓度变为1.0 mg/L后，添加200 μL抗PA标签抗体琼脂糖珠，4℃温度条件下，搅拌3小时。

　　分别用不同浓度的TBS溶液（0.15 M、0.5 M、1.0 M NaCl）进行调整，用琼脂糖珠50倍量清洗。在回收的各珠中加入0.5 mL 0.1 M Glycine-HCl(pH 2.7)，室温条件下平稳震动5 min。

　　离心后回收上清，用1 M Tris-HCl (pH 9.0)做中和处理。

　　SDS-PAGE后进行银染，比较去除污染蛋白之后，不同浓度下的结果。


◆使用案例：Western Blotting

PA标签系统 重组蛋白纯化检测用
数据提供：东北大学研究生院医学系研究科 

地域革新领域 加藤 幸成老师，金子   美华老师

NZ-1显示出与天然抗体具有相同的高检测灵敏度。

Lane 1

一抗：抗IDH1抗体（RcMab-1）, 1 μg/mL

二抗：抗大鼠IgG-HRP标签, 1000倍稀释
 
 Lane 2

一抗：抗PA tag抗体, 1 μg/mL

二抗：抗大鼠IgG-HRP标签, 1000倍稀释
 
Lane 3

一抗：抗DYKDDDDK标签抗体, 3.5 μg/mL

二次抗体：抗小鼠IgG-HRP标签, 1000倍稀释
 
样品量：各10 μg
曝光时间：10分钟

 


◆PA标签系列


产品名称

子类克隆号

适用实验

规格

产品编号

包装

单抗

抗PA标签, 大鼠单抗

Anti PA tag, Rat Monoclonal Antibody

大鼠IgG2a
  NZ-1

IP, WB, FCM, ICC

免疫化学用

016-25861

200 μL

012-25863

1 mL

HRP标签单抗

抗PA标签, 大鼠单抗,过氧化酶结合

Anti PA tag, Rat Monoclonal Antibody, Peroxidase Conjugated

大鼠IgG2a

NZ-1

WB

免疫化学用

015-25951

200 μL

011-25953

1 mL

 


产品名称

子类克隆号

规格

产品编号

包装

抗体结合琼脂糖珠

抗PA标签抗体琼脂糖珠

Anti PA tag Antibody Beads

大鼠IgG2a   NZ-1

免疫化学用

012-25841

2 mL(Net 1 mL)

018-25843

10 mL

(Net 5 mL)

016-25844

50 mL

(Net 25 mL)

 识别N端、C端的PA标签
 使用载体：4% 琼脂糖
 溶液组成：1 x PBS (pH7.2), 0.05 w/v%叠氮化钠
 抗体结合量：参见标签记载
 结合容量：1 mL本品可结合约0.015-1.0 mg的PA标签融合蛋白

抗体结合磁珠

MagCaptureTM HP 抗PA标签抗体磁珠

MagCapture™ HP Anti PA tag Antibody Magnetic Beads

大鼠IgG2a   NZ-1

免疫化学用

137-18751

2 mL

溶液组成：1×TBS(pH 7.4), 50% glycerol, 0.05 w/v% sodium azide

 


产品名称

备注

规格

产品编号

包装

肽

PA标签肽

PA tag Peptide

含量（HPLC）95%以上

基因研究用

167-25501

5 mg

163-25503

25 mg

清洗溶液

PA标签清洗溶液

PA tag Washing Solution

已过滤消毒
即用型

基因研究用

169-27261

50 mL

 


产品名称

可选Marker

产品编号

包装

大肠杆菌

动物细胞

瞬时载体

pCAG-Ble PA 标签-C

pCAG-Ble PA tag-C

Bleomycin

161-26861

20 μg

pCAG-Ble PA 标签-N 信号 增加型

pCAG-Ble PA tag-N Signal Plus

Bleomycin

168-26871

20 μg

pCAG-Bsd PA 标签-C

pCAG-Bsd PA tag-C

Blasticidin S

165-26881

20 μg

pCAG-Bsd PA 标签-N 信号 增加型

pCAG-Bsd PA tag-N Signal Plus

Blasticidin S

162-26891

20 μg

pCAG-Neo PA 标签-C

pCAG-Hyg PA tag-C

Hygromycin B

165-26901

20 μg

pCAG-Hyg PA 标签-N 信号 增加型

pCAG-Hyg PA tag-N Signal Plus

Hygromycin B

162-26911

20 μg

pCAG-Neo PA 标签-C

pCAG-Neo PA tag-C

Kanamycin

G418

169-26921

20 μg

pCAG-Neo PA 标签-N 信号 增加型

pCAG-Neo PA tag-N Signal Plus

Kanamycin

G418

166-26931

20 μg



◆相关产品


内参照

下表为Western Blot实验中参照用单抗一览表。


产品名称

规格

产品编号

包装

抗β肌动蛋白单抗
  Anti β-Actin, Monoclonal Antibody

免疫化学用

013-24553

200 μg

011-24554

1 mg

017-24556

5 mg

抗β肌动蛋白单抗,过氧化物酶标记

Anti β-Actin, Monoclonal Antibody,   Peroxidase Conjugated

免疫化学用

017-24573

200 μL

抗α-微管蛋白, 单抗

Anti α-Tubulin, Monoclonal Antibody

免疫化学用

011-25034

10 μg

017-25031

200 μg

013-25033

1 mg

Anti β-Tubulin, Monoclonal Antibody
  抗β-微管蛋白, 单抗

免疫化学用

018-25044

10 μg

014-25041

200 μg

010-25043

1 mg

Anti GAPDH, Monoclonal Antibody
  抗GAPDH, 单抗

免疫化学用

016-25523

200 μg

014-25524

1 mg

010-25526

5 mg

Anti GAPDH, Monoclonal Antibody, Peroxidase   Conjugated
  抗GAPDH, 单抗, 过氧化酶结合

免疫化学用

015-25473

200 μL

 


蛋白酶抑制剂系列


产品名称

规格

产品编号

包装

蛋白酶抑制剂混合物试剂盒 I，无动物源成分（通用型）

Protease Inhibitor Cocktail Set I, Animal-derived-free (for general use) (×100), Lyophilized

通用型

165-26021

1 mL用

161-26023

1 mL用×5

蛋白酶抑制剂混合物试剂盒III,   DMSO溶液（不含EDTA）（×100）
  Protease Inhibitor Cocktail Set III, DMSO Solution   (EDTA free) (×100)

动物细胞

163-26061

1 mL

169-26063

1 mL×5

蛋白酶抑制剂混合物试剂盒V （无EDTA）（×100）
  Protease Inhibitor Cocktail Set V (EDTA free) (×100), Lyophilized

2D电泳

162-26031

1 mL

168-26033

1 mL×5

蛋白酶抑制剂混合物试剂盒 VI，DMSO溶液，用于植物（×100）
  Protease Inhibitor Cocktail Set VI, DMSO Solution (for Plant) (×100)

植物细胞

164-26091

1 mL

160-26093

1 mL×5

蛋白酶抑制剂混合物试剂盒VII，DMSO溶液，组氨酸标签蛋白（×100）
  Protease Inhibitor Cocktail Set VII, DMSO Solution   (for Histidine-tagged Protein) (×100)

His Tag 纯化※

167-26101

1 mL

163-26103

1 mL×5

亲和标签比较表

亲和标签

TARGET

PA

6xHis

氨基酸序列

(YPGQ)5V

GVAMPGAEDDVV

HHHHHH

残基数

21

12

6

分子量 (kDa)

2.34

1.16

0.84

等电点（pI）

5.52

3.49

7.21

配体

TARGET tag

PA tag

Ni, Co, Zn, Cu

亲和珠回收

40% Propyleneglycol,
  1×TBS(pH7.5)

3M MgCl2, MES(pH6.0)

0.5M Imididazole(pH7.4)

单抗边界强度

（KD（M））

1.0×10-8

4.9×10-10

Ni-NTA:
  1.0×10-5～-6

单抗

Clone No.

P20.1(Mouse)

NZ-1(Rat)

Merck:HIS. H8(Mouse)

亲和力

++++

+++++

+++

提纯成本

+

+

+

多肽洗脱

+++

+++

Imidazole

背景

（培养上清）

+

+

+++++

背景

（细胞裂解物）

+

+

++++

亲和标签

DYKDDDDK

c-Myc

HA

GST

氨基酸序列

DYKDDDDK

EQKLISEEDL

YPYDVPDYA

–

残基数

8

10

9

218

分子量 (kDa)

1.01

1.20

1.10

26

等电点（pI）

3.97

4.00

3.56

–

配体

DYKDDDDK tag

c-Myc tag

HA tag

GST

亲和珠回收

Tris-HCl,
  Glycine Buffer(pH2～3.5)

Tris-HCl,
  Glycine Buffer(pH2～3.5)

Tris-HCl,
  Glycine Buffer(pH2～3.5)

Glutathione,
  Tris-HCl,
  Glycine Buffer(pH2～3.5)

单抗边界强度

（KD（M））

2.8×10-8

2.2×10-9

2.8×10-9

Glutathione:
  1.0×10-5～-6

单抗

Clone No.

M2(Mouse)

9E10(Mouse)

3F10(Mouse)
  HA-7(Rat)

Wako:5A7(Mouse)

亲和力

++++

++++

++++

++++

提纯成本

++

++

++

+

多肽洗脱

+++

++

++

Glutathione

背景

（培养上清）

++++

+++

+++

++++

背景

（细胞裂解物）

++++

++++

+++

++++

　　本比较表为Wako独家调查的数据。样品、检测方法和手法的不同，特异性也会有所变化，因此无法保证各个亲和标签的功能。

 

产品编号 产品名称 产品规格 产品等级