UltraRIPA kit for Lipid Raft

大幅度提升膜蛋白提取效率的新一代RIPA缓冲液
　　

　　与常规的非变性细胞裂解缓冲液（RIPA buffer, 1% Triton X-100等）相比，这款缓冲液套装（Buffer Kit）能迅速且高效地提取增溶相对困难的脂筏（Lipid Raft）蛋白质。从常规缓冲液中不可溶而丢弃的膜组分中，在维持蛋白质功能的情况下能实现高效地提取，有利于对脂筏等蛋白质的功能分析。

　　※本产品仅限于研究用。不可用于临床治疗。

◆细胞膜的可溶化和脂筏（Lipid Raft）

　 　裂解细胞进行蛋白质功能分析的时候，经常会使用RIPA （Radio-ImmunoPrecipitation Assay）缓冲液和1% Triton X-100缓冲液等的相对温和的细胞膜裂解缓冲液。这些缓冲液对蛋白质的构造和功能的影响小，适用于酶活性试验、免疫沉降和各种结合实验等蛋白质的功能分 析。另一方面，与具有很强的蛋白质变性作用的SDS缓冲液相比，增溶能力较弱，完全不能溶解以脂筏（Lipid Raft）为主的细胞膜组分。许多表面活性剂都不能溶解脂筏，故其又被称为Detergent Resistant Membrane (DRM）。DRM中所含蛋白质的功能分析被认为是十分困难的。

　 　脂筏（Lipid Raft）是由胆固醇（cholesterol）和鞘磷脂（sphingomyelin），GPI锚定蛋白（GPI anchor protein）和棕榈酰化（palmitoylation）蛋白质组成的细胞膜构造，被认为是整合各种功能蛋白的功能域。神经细胞突触和免疫细胞的免疫 突触是脂筏的代表性例子。

脂筏示意图

◆特点

　　●　操作简单，能快速提取脂筏蛋白

　　●　使用两种类型的缓冲液（A buffer，B buffer）进行两个阶段的提取。先提取出胞浆蛋白和非脂筏蛋白，然后提取脂筏蛋白

　　●　Buffer提取的任何蛋白质都不会失活

　　●　A buffer和一般的RIPA buffer成分相同＊。B buffer含有表面活性剂，可以通过透析除去

　　●　适用于哺乳动物细胞/组织

　　●　使用本品配制的溶解液适用于酶活性试验、免疫沉淀（Immunoprecipitation）、蛋白定量（BCA法）、SDS-PAGE和Western blot等

　　＊　1％ NP-40 Alternative，0.1％ SDS，50 mMTris-HCl (pH8.0)，150 mMNaCl，0.5％ Sodium Deoxycholate

◆缓冲液套装组成

　　●　A buffer (RIPA buffer) （100 mL）

　　●　B buffer （10 mL）

◆使用方法

　　1、用A buffer溶解组织或培养细胞。
　　※为了提高溶解效率，推荐使用均质或超声波破碎设备。

　　2、进行离心分离，使A buffer中可溶性组分（上层清液）和不溶性组分（沉淀）分离，分别回收。上层清液A buffer可溶性组分中主要含有胞浆蛋白和非脂筏蛋白。

　　3、往沉淀的A buffer 不溶性组分中加入B buffer，形成悬浊液。

　　4、进行离心分离，与步骤2一样分离出可溶性组分（上层清液）和不溶性组分（沉淀），分别回收。上层清液的B buffer可溶性组分中含有脂筏蛋白。

　　5、可应用于各种实验。

　　※A buffer和B buffer不可用于Bradford法蛋白质定量。蛋白质定量请使用BCA检测。

　　※使用本品A buffer和B buffer进行两个阶段的提取是最适宜的，也有只对细胞使用B buffer进行溶解和提取的例子。具体请参照以下例子。

UltraRIPA kit 、1% SDS buffer和RIPA buffer的比较

◆应用例

从脂筏中提取总蛋白

　 　用UltraRIPA kit A buffer溶解小鼠全脑组织后，回收A buffer不溶性组分（RIPA-insoluble fraction），添加2% SDS，RIPA buffer 和UltraRIPA kit B buffer进行提取。提取后的总蛋白用SDS-PAGE/银染色检测（左），用BCA法定量蛋白质（右）。相对于具有很强的蛋白质变性作用的2% SDS缓冲液，UltraRIPA kit能够提取70%以上的蛋白质。

　　※不能保证全部蛋白质的可溶性都得到改善。

脂筏标记蛋白的提取

　 　用UltraRIPA kit A buffer溶解小鼠全脑组织后，回收A buffer不溶性组分（RIPA-insoluble fraction），添加2% SDS，RIPA buffer 和UltraRIPA kit B buffer，提取后进行SDS-PAGE。利用对应脂筏标记蛋白的抗体进行Western blot检测。
 

脂筏标记蛋白的免疫沉淀

　 　用UltraRIPA kit A buffer溶解小鼠全脑组织后，回收A buffer不溶性组分，通过B buffer提取脂筏标记蛋白。对 buffer提取物使用脂筏标记蛋白PSD95的抗体和G蛋白偶联磁珠进行免疫沉淀。使用银染色和抗PSD95抗体通过Western blot检测进行确认。

提取的蛋白质的酶活性测定

　 　用1%TritonX100，RIPA buffer，UltraRIPA kit B buffer 和2%SDS溶解CHO细胞，测定溶解物中乳酸脱氢酶（LDH）的活性。2%SDS具有很强的蛋白质变性作用，在几乎完全失活的情况下，1% Triton X100，UltraRIPA kit A buffer，和UltraRIPA kit B buffer所得的酶活性大致相同。

从脂筏中提取功能蛋白

　 　用UltraRIPA kit A buffer溶解小鼠全脑组织后，回收A buffer不溶性组分。用A buffer分三次冲洗不溶性组分，消除RIPA可溶性组分中脱磷酸酶的活性。往不溶性组分中分别添加2% SDS buffer，A buffer（RIPA buffer）和B buffer，测定各种提取物的总脱磷酸化酶活性。下图是各缓冲液从RIPA不溶性组分中提取的蛋白质的量（左轴：黑）和所检测的脱磷酸酶的活性（右轴： 红）的示意图。2% SDS buffer能够从RIPA不溶性组分中很好地提取蛋白质，但容易导致蛋白质变性，完全失去脱磷酸化活性。RIPA buffer不能提取蛋白质，活性也无法检测。UltraRIPA kit B buffer所提取的蛋白质大约为2% SDS buffer的70%，且可以检测出较强的脱磷酸化活性。

UltraRIPA kit B buffer单独提取脂筏蛋白的可能性评价

※数据提供：东京大学药学院研究生院保健化学系

　 　用PBS冲洗COS-1细胞，分别使用SDS buffer，1% Triton X-100 buffer，UltraRIPA kit A buffer 和UltraRIPA kit B buffer裂解，通过离心分离（14,000 rpm, 5 min,4℃）可溶性组分和不可溶性组分。不可溶性组分用等量的SDS-PAGE样品缓冲液变性溶解。脂筏标记Flotilin1的可溶部分通过SDS- PAGE / western blot测定。使用1% Triton X-100和RIPA buffer，大部分的Flotilin 1不溶性膜组分没有被溶解，而UltraRIPA kit B buffer几乎可以全部溶解。

◆各buffer组成

　　●　SDS buffer （2%SDS, 1% Triton X-100, 50 mM HEPES・Na (pH 7.2), 150 mMNaCl）

　　●　UltraRIPA kit A buffer (1％ NP-40 Alternative，0.1％ SDS，50 mMTris-HCl (pH8.0)，150 mMNaCl，0.5％ Sodium Deoxycholate)

　　●　UltraRIPA kit B buffer (成分保密)

　　●　1% Triton X-100 (1% Triton X-100, 50 mM HEPES・Na (pH 7.2), 150 mMNaCl）