可检测未分化细胞数   

rBC2LCN（AiLecS1）来源于Burkholderia cenocepacia，凝集素BC2L-C的N末端域在大肠菌表达的重组蛋白。 　　rBC2LCN对人类ES/ iPS细胞表面足糖萼蛋白的粘蛋白O-型糖链–H-3型（Fucα1-2Galβ1-3GalNAc）具有高亲和性，因此rBC2LCN被认为是可以检测人类ES/ iPS细胞的未分化标志物。 　　通过rBC2LCN把糖蛋白（H-3型聚合足糖萼）从人类ES/iPS细胞表面释放到培养液中。该试剂盒通过rBC2LCN和未分化标记抗体的 Sandwich Assay测定法，定量测定从人类ES/iPS细胞表面释放到培养中的糖蛋白数量，进而可推算出人类ES/iPS细胞数。

◆特点

　●　通过对培养上清的分析，监测未分化细胞数的增减。

　●　因其测定对象为培养上清，不会在检查过程中消耗细胞数量，且可在此过程中继续进行细胞培养

　●　少量的培养上清（50μL）即可分析

　●　采用ELISA测定法，可简单快速的处理多样品

试剂盒构成

◆原理

标准曲线制作

该试剂盒中未含有绘制标准曲线用的标准品。因此，请按照下述顺序调制标准品后，再行绘制标准曲线：

1.　在未分化维持培养条件下进行人类ES/ iPS细胞培养，更换培养基的第二天（18至24小时后）回收培养上清。

2.　细胞剥离，测定人类ES/ iPS细胞数。

3.　计算出回收到的培养上清中所含的人类ES/ iPS细胞数。如：培养基量5ml，测定细胞数为5×106cells 时，则回收培养上清中的人类ES/ iPS细胞数即为1×106cells/mL。

4.　利用回收的培养上清未分化维持用培养基或已分化培养基，制成已知细胞浓度的稀释系列，以绘制标准曲线。

◆分化诱导时的使用案例
 

1.　在未分化维持培养时，对人类ES/iPS细胞的培养上清进行取样，计算人类ES/iPS细胞数。

2.　在分化用培养基中对第1项的培养上清进行稀释，制成稀释系列，以绘制该试剂盒的标准曲线。

3.　使用本试剂盒测定可确认人类ES/iPS细胞数的培养上清。

4.　推算分化条件下残存的人类ES/iPS细胞数

【细胞株间和培养基间的比较】

　 　在各个未分化维持用培养基（培养基A、B、C、D）中分别培养人类iPS细胞201B7株和253G4，更换培养基后第二天回收培养上清。计算细胞数 量，用各个未分化维持用培养基将各培养上清稀释至2,000cells/mL，进而测定该试剂盒的吸光度。测定结果如下图所示。结果表明，即使细胞株或培 养基等培养条件的细胞数量恒定，信号强度也有差异。因此，必须为培养条件绘制标准曲线。

【人类iPS细胞培养上清的测定】

　 　用StemSure® hPSC培养基培养人类iPS细胞201B7株，更换培养基第二天回收该培养基的培养上清。于此同时，计算细胞数量，阶段性的在StemSure® hPSC培养基中稀释培养上清，并将稀释后的培养上清用试剂盒检测。结果可得到一个极高相关系数的线性公式。根据这个线性公式求出该培养条件下的人类 iPS细胞检测下限值※为108 cells/mL。

※检测下限值：根据培养基背景吸光度平均值+3.3SD和线性公式计算出来的细胞数量。

【分化细胞培养上清和人类iPS细胞培养上清液混合检测】

　 　将含有成纤维细胞和人膝关节软骨（NHAC-kn）细胞的血清培养基上清与人类iPS细胞培养上清混合后，确认能否测定添加在其中的未分化细胞标志物。 将iPS细胞混合比例0~20%（0～2×104 cells/mL：总细胞数 1×105 cells/mL）的人类iPS细胞培养上清，混合到成纤维细胞和人膝关节软骨细胞培养上清中，用试剂盒检测。在血清和成纤维细胞存在的条件下，可在培养 上清中测定出人类iPS细胞培养上清。

　　另外还可从成纤维细胞/人膝关节软骨细胞和iPS细胞的混合试验材料中得出一个线性公式，根据该公式可求出人类iPS细胞的检测下限值※，分别为：170 cells/mL和96 cells/mL。

使用注意项

●　由于细胞株、培养基种类等培养条件的不同，会导致信号轻度和细胞数的关系产生差异，所以必须绘制细胞株、未分化维持培养条件、分化诱导培养基标准曲线。
●　不同培养条件下，不能依靠信号强弱来评定未分化性。未分化性的评定一定要在相同培养条件下进行。

●　用该试剂盒测算出来的ES/iPS细胞数与实际细胞数未必一致。对未分化维持状态和进行细胞分化的监控，也是需要参考的指标之一。