VA-044

用于脂质提取的聚合物引发剂

　　一个世纪以来，生物学家们一直梦想着能够透过器官甚至整个机体，亲眼看到细胞连接和精细结构，现在随着组织透明化技术的完善，这一梦想终于成为了现实。

◆原理

VA-044 作为组织透明化技术中起关键作用的水溶性偶氮引发剂，普遍适用于高分子合成的水溶液聚合与乳液聚合。在CLARITY 方法中，VA-044 作为引发剂，催化丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺和PFA 形成水凝胶。

2013 年3 月，斯坦福大学的Karl Deisseroth 博士领导的团队在自然杂志（Nature）上发表了Structural and molecularinterrogation of intact biological systems 的论文，文中介绍了制备组织的方法CLARITY。该方法是将组织浸透在水凝胶单体溶液中（Hydrogel Monomer Solution）中，经电泳使组织呈现透明。这种水溶胶—组织杂交的方式可以维持组织的原有结构，使生物分子结合到水凝胶的网孔上。重要的是脂类不会结合到水凝胶上，因而可以通过这种方式将脂类有效去除。通过这种方法制备的组织样品可用于后期的影像实验，免疫染色，原位杂交等实验。

　　CLARITY可用于荧光蛋白质和抗体的免疫染色，可作为解析脑神经回路的有效工具。VA-044是论文实验步骤中透明化工程的使用试剂。

◆特点• 优势

●   操作简单，固定蛋白后只需进行电泳；

●    可保持组织、器官和全身结构的完整性；

●     可进行原位杂交和免疫组化实验，可进行多轮染色和脱色步骤；

◆案例•应用

Clarity 介绍

PARS 介绍

2014 年7 月，加州理工学院的研究团队在细胞杂志（Cell）上发表论文Single-Cell Phenotyping within TransparentIntact Tissue through Whole-Body Clearing，将CLARITY 技术推进到一个新的高度——全身组织透明化技术，称为PARS(Perfusion-assisted Agent Release in Situ)。这种技术将透明剂持续泵入动物的循环系统从而进入各个组织，或者通过脑脊液管道泵入大脑，再去除脂质，使器官和生物体被高分子渗透而呈现透明，并可用荧光抗体分析和揭示具有完整连接性的细胞结构和三维细胞排列。

图A. PARS 建立的小鼠透明化肠，并用凝集素（lectin） 亚甲基蓝(methylene blue)、DAPI 进行免疫标记后成像  并获得三种免疫标记的叠加图（merge）	图B. PARS 建立的小鼠透明化肾脏并用抗微管蛋白抗体 和DRAQ5 进行免疫标记后成像，并获得两种免疫 标记的叠加图

CLARITY处理的小鼠脑

CLARITY处理的小鼠大脑成像

CLARITY处理的Thy1-YFP（H Line）小鼠大脑的荧光观察
（A）从大脑皮质到海马的3-D观察图像
（B）大脑皮层Ⅴ层的锥体细胞的树突图像
拍摄条件：双光子   使用设备：Olympus FV1000直立显微镜，25倍浸液物镜

CLARITY+抗体处理的小鼠大脑成像

CLARITY处理后，用Iba1抗体染色Thy1-YFP（H线）小鼠大脑的荧光观察
（A）在大脑皮质的小胶质细胞的3-D观察图像
（B）从表面层观察皮质Ⅰ层的图像
拍摄条件：单光子   使用设备：Olympus FV1000直立显微镜，25倍浸液物镜

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