优化原位杂交（ISH）的10个小技巧
10 Tips for Optimizing In Situ Hybridization (ISH)
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Enzo Life Sciences在研究试剂盒，生物化学品和生物制品的制造和供应方面拥有40多年的经验。作为为科学家提供支援的科学家，我们很乐意提供简单但有用的技巧，以改善您日常任务以及研究的整体质量。从这一点出发，以下我们为您提供了在原位杂交中获得高质量数据的综合技巧。原位杂交是一种广泛使用的生物技术，它能为准确定位分裂中期滴片、细胞和组织中内源性的、细菌或病毒的核酸（如DNA，mRNA和microRNA）。 |
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1．合适的探针
由于杂交可以发生在互补的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸之间，故DNA或RNA探针（又称为核糖探针）都可以用于定位给定样品中的DNA或RNA。然而，RNA-RNA杂交体比RNA-DNA杂交体更稳定，而RNA-DNA杂和体又比DNA-DNA杂合体更稳定。双链DNA探针易于在实验室中进行制备、标记和使用；而单链RNA探针的大小均一，可实现标记的高度插入，并形成高度稳定的RNA-RNA杂交体。而且，单链寡核苷酸探针（Oligonucleotides）如今可以通过化学方法简单地合成并且加上高比放射性。目前，也可以使用肽骨架或锁核酸（LNA）作为替代品，以提高杂交效率和稳定性。
2．合适的标签
用于组织微阵列的放射性标记探针应使用35S-NTP，以避免信号溢出。如果实验目的是使与周围细胞或组织结合的探针可视化（最常见的情况），那么您可以选择能够使探针能被直接检测的一系列荧光染料。又或者，您可以使用如生物素、地高辛或者色原体等间接标记，这类标记不易随着时间变化而发生信号猝灭，与免疫组织化学（IHC）类似。
3．正确的标记技术
缺口平移法或随机引物标记法是产生长的双链DNA探针的方法（推荐使用ENZ-GEN111-0050），而使用含RNA聚合酶启动子的载体则可用于体外转录以制备RNA探针。寡核苷酸可以在其合成期间直接标记，或者可以使用末端脱氧核苷酸转移酶或T4多聚核苷酸激酶将标记的核苷酸添加至其末端。
4．合适的检测方法
由于荧光标记可以在FISH探针合成期间引入并通过荧光显微镜检测，因此可以进行直接检测。这样，可以容易地进行多重检测，因为可以在任何时间观察两种或更多种不同荧光团标记的不同探针（推荐ENZO SEEBRIGHTTM系列）。生物素标记可以用来自蛋清的亲和素或来自细菌S. avidinii的链霉亲和素检测，而地高辛可以与地高辛抗体配对。两种间接标记方法最终可以用碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）来处理，与特定底物反应产生CISH的显色沉淀，从而达到可视化的目的。
5．优化蛋白酶K的消化
蛋白酶K的消化是ISH成功的关键步骤，因为消化不足将导致杂交信号减弱。另一方面，如果样品过度消化，组织的形态将会很差或完全被破坏，导致无法定位杂交信号。因此，蛋白酶K的最佳浓度会根据组织类型、固定长度和组织大小而变化。 通常，在室温下使用1-5 μg/ mL蛋白酶K处理 10min是开展ISH的一个不错的起始点。蛋白酶K消化最佳条件的确定应以系列不同浓度的蛋白酶K进行滴定，然后再与所选择的探针杂交。产生最高杂交信号且蛋白质组织或细胞形态被破坏最少时的蛋白酶K浓度即为您应该选择的浓度。
6．强化杂交条件
强化杂交条件的目的是仅在探针和其靶标之间获得杂交，从而实现可能的最高特异性。杂交特异性（严格度）主要由探针和靶核酸序列之间的同源性程度、探针浓度、温度和杂交时间，以及杂交溶液中存在的单价阳离子的浓度所决定。尤其应该仔细地优化杂交温度，通常在55和62°C之间，以获得高度特异性的结果。甲酰胺允许杂交在显著低于探针-靶-杂交体的实际解链温度的温度下进行，从而有助于保护样品的形态。为了更好地标记目的基因，通常会引入COT序列（ENZ-GEN116-0500）以减少与重复DNA序列的非特异性杂交。
7．优化杂交后处理条件
反应之后，接下来进行的是增加严格度的杂交后洗涤，以出去不完全的配对，使靶序列上仅留下特异性结合的探针。如果您在ISH分析中遇到高背景，您可以用核酸酶消化非特异性结合的探针来进一步降低背景。例如，在进行检测步骤之前，使用S1核酸酶处理DNA探针，使用RNase来处理RNA探针。
8．如果使用DNA探针，修改洗涤步骤
DNA探针有着与RNA探针相同的灵敏度，但DNA探针不能像RNA探针那样与样品中的靶分子结合得那么牢固。 因此，当使用DNA探针时，不应在杂交后使用甲醛洗涤。
9．优化检测
使用生物素标记的探针时，请注意生物素也是在细胞和组织中产生的内源性物质。因此，内源性的生物素可能导致非特异性染色，因为基于（链霉）亲和素的检测系统将与样品中所有可接触的生物素分子结合。在这些情况下，您需要通过在探针杂交之前向样品中添加过量（链霉）亲和素来阻断内源性生物素，或者您应该使用地高辛代替生物素来作为探针标记。地高辛是从洋地黄植物中分离的非放射性免疫标签，因此不太可能被除抗地高辛抗体之外的生物材料检测到。因此，地高辛标记的使探针检测有着高亲和力、高灵敏度以及最重要的特异性。
10．经常更换试剂
为了获得最具可重复性和有效的数据，应每2-3周补充一次三乙醇胺和乙酸酐，每3-4天更换10％中性甲醛溶液（NBF）。
相关产品
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产品编号 |
产品名称 |
用途 |
包装 |
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ENZ-GEN111-0050 |
Nick translation DNA labeling system 2.0 |
ISH(in situ hybridization) |
50 tests |
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ENZ-42853 |
SEEBRIGHT™ Aqua 431 dUTP |
FISH |
25 nmol |
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ENZ-42831 |
SEEBRIGHT™ Green 496 dUTP |
FISH |
25 nmol |
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ENZ-42843 |
SEEBRIGHT™ Gold 525 dUTP |
FISH |
25 nmol |
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ENZ-42842 |
SEEBRIGHT™ Orange 552 dUTP |
FISH |
25 nmol |
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ENZ-42844 |
SEEBRIGHT™ Red 580 dUTP |
FISH |
25 nmol |
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ENZ-42505 |
Cyanine 3-UTP (enhanced) |
用于标记 |
250 nmol |
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ENZ-42506 |
Cyanine 5-UTP (enhanced) |
用于标记 |
250 nmol |
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ENZ-ACC102-0150 |
SAVIEW® PLUS HRP reagent |
IHC |
150 tests |
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ENZ-ACC111-0150 |
SAVIEW® PLUS AP Reagent |
IHC |
150 tests |
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ENZ-NUC113-0025 |
Digoxigenin-dUTP, alkali-stable |
用于标记 |
25 nmol |
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ENZ-NUC114-0250 |
Digoxigenin-UTP, alkali-stable |
用于标记 |
250 nmol |
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ENZ-GEN114-6000 |
DIGX® HPV type 16/18/31/33/51 probe |
ISH (in situ hybridization) |
6 mL |
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ENZ-GEN114-1000 |
1 mL |
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ENZ-GEN112-6000 |
DIGX® HPV type 6/11 probe |
ISH (in situ hybridization) |
6 mL |
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ENZ-GEN112-1000 |
1 mL |
||
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ENZ-GEN113-6000 |
DIGX® HPV type 16/18 probe |
ISH (in situ hybridization) |
6 mL |
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ENZ-GEN113-1000 |
1 mL |
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ENZ-ABS304-6000 |
DIGX® Mouse anti-digoxigenin linker (Ready-to-Use) |
ISH (in situ hybridization) |
6 mL |
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ENZ-ABS303-6000 |
DIGX® Rabbit anti-digoxigenin linker (Ready-to-Use) |
ISH (in situ hybridization) |
6 mL |
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ENZ-ACC114-0150 |
POLYVIEW® PLUS AP (anti-mouse) reagent |
IHC |
150 tests |
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ENZ-ACC104-0150 |
POLYVIEW® PLUS HRP (anti-mouse) reagent |
IHC |
150 tests |
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ENZ-ACC103-0150 |
POLYVIEW® PLUS HRP (anti-rabbit) reagent |
IHC |
150 tests |
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ADI-950-170-0030 |
HIGHDEF® yellow IHC chromogen (HRP) |
IHC |
30 mL |
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ADI-950-150-0030 |
HIGHDEF® blue IHC chromogen (AP) |
IHC |
30 mL |
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ADI-950-171-0030 |
HIGHDEF® black IHC chromogen (HRP) |
IHC |
30 mL |
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ENZ-32885 |
PATHO-GENE® HPV type 6/11 probe |
HPV探针 |
1 mL |
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ENZ-32885-6000 |
6 mL |
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ENZ-32886 |
PATHO-GENE® HPV type 16/18 probe |
HPV探针 |
1 mL |
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ENZ-32886-6000 |
6 mL |
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|
ENZ-32887 |
PATHO-GENE® HPV type 31/33/51 probe |
HPV探针 |
1 mL |
|
ENZ-32887-6000 |
6 mL |
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|
ENZ-32882-6000 |
PATHO-GENE® HPV type 16/18/31/33/51 probe |
HPV探针 |
1 mL |
|
ENZ-32882-1000 |
6 mL |
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|
ENZ-32884 |
PATHO-GENE® HPV screening probe |
HPV探针 |
1 mL |
|
ENZ-32884-6000 |
6 mL |
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ENZ-32895 |
PATHO-GENE® AP-NBT/BCIP HPV in situ typing assay （ 6/11, 16/18 和 31/33/51型） |
Colorimetric detection |
10 assays |
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ENZ-32879 |
PATHO-GENE® AP-NBT/BCIP HPV in situ screening assay |
Colorimetric detection |
20 assays |
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ENZ-33905-0050 |
In situ hybridization buffer for HPV probes (Ready-to-Use) |
HPV探针用缓冲液 |
50 mL |
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ENZ-33809 |
In situ hybridization wash reagent |
原位杂交洗涤试剂 |
30 mL |
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ENZ-32893-6000 |
Mouse anti-biotin linker (Ready-to-use) |
ISH (in situ hybridization) |
6 mL |
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ENZ-32892-6000 |
Rabbit anti-biotin linker (Ready-to-use) |
ISH (in situ hybridization) |
6 mL |
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ENZ-31877 |
HPV 16 control slide |
positive control for DNA in situ hybridization of HPV-16 |
1 slide |