粘蛋白检测试剂盒

Mucin Assay Kit

——健康和美容研究试剂

 

◆背景

　　粘蛋白属于高度糖基化蛋白质家族，是粘膜的主要成分，例如唾液，泪液，胃液，肠液。粘蛋白的 基本构型是枝状糖链连接到多肽的大分子。糖链的非均质特性使其具有多样性，分子具有各种功能，如特异性分子识别。
　　一些糖链识别病毒和细菌的特定蛋白质。粘蛋白锚定在肠中粘膜屏障功能中，阻止病原体和毒素通过肠壁进入血管中。该试剂盒可用于检测粪便中的粘蛋白含量。
　　粘蛋白属于高分子（1000kda-10000kda）高度糖基化蛋白的家族。蛋白质核内的粘蛋白结构域富含苏氨酸、丝氨酸和羟脯氨酸，糖链的还原末端（GalNAc）通过翻译后O-糖基化与这些氨基酸频繁连接。该试剂盒具有确定粪便粘蛋白含量组分的功能。
　　粪便粘蛋白测定可用作肠屏障功能的指标。该试剂盒利用荧光检测来测定粘蛋白的含量。

　　我们提供的该试剂盒可以供研究功能性食物和感染的客户使用。

　　步骤1：从粪便中提取和部分纯化粘蛋白。
　　步骤2：粘蛋白O-糖苷连接的寡糖链的测定通过稀碱进行β-消除，形成糖链的还原端。还原碳水化合物在高温下进行荧光标记以产生荧光缩合物。

粘蛋白的结构

 ◆试剂盒组分

组件	规格	数量	储存条件
缓冲溶液A	100mL	3	4-10℃
缓冲溶液B	25mL	1
缓冲溶液C	25mL	1
试剂A	1.0mL	1
试剂B	1.5mL	2
标准溶液（GalNA，250ug/mL）	1.0mL	1
酶溶液	1.5mL	1

◆优点・特色

●  粘蛋白和IgA能阻止细菌和毒素的入侵

●  作为肠屏障的一部分，粘蛋白和IgA能防止病原菌和毒素通过肠壁转移到血管内。

测定理论
　　通过对粪便中的β-葡萄糖苷酶热变性防止粪便粘蛋白降解
　　↓
　　粗提取粘蛋白
　　↓
　　用酶溶液分解淀粉
　　↓
　　用乙醇沉淀纯化粘蛋白
　　↓
　　将试剂A加入纯化的粘蛋白中，并在碱性条件下进行热处理。 （试剂A将与粘蛋白的糖还原末端反应，并在碱处理后发出荧光）
　　↓
　　加入缓冲液C并测定荧光强度（激发336nm，荧光383nm）

　　（具体操作请看相关资料）

◆案例・应用

喂食高脂肪食物的大鼠肠屏障部分注射多酚的效果

图1 粘蛋白定量标准曲线

图2 粪便中的粘蛋白含量

应用

　　用于测定粪便中的粘蛋白含量。

 

相关资料

Mucin_Assay_Kit.

◆操作步骤

●　本产品是专为荧光酶标仪测量设计（96孔板）。
●　当使用荧光读板机时，可测量100个样品。
●　当使用分光光度计测量时，请使用微细胞。

缓冲液A的制备
用100mL蒸馏水溶解1块片剂。
粪便粉末的制备：粪便冻干并在研钵中研磨，储存在-20℃备用。

II.粪便粘蛋白的测定
　　1、称量100mg粪便粉末放入微量试管（2mL）中，加入1mL缓冲液A，然后用涡流混合器混合30秒钟。

　　2、在95℃下加热试管10分钟使细菌的糖苷酶变性。

　　3、在37℃下加热90分钟，从粪便中提取粘蛋白。

　　4、在4℃下离心20,000×g 15分钟。
　　5、将200μL上清液转移到另一个微量试管中，加入200μL缓冲液B，用涡流混合器混合溶液。

　　6、加入10μL酶溶液混合，在50℃下加热试管20分钟分解淀粉。
　　7、将离心管冷却至室温，加入125μL的99.5％乙醇，混合后，在-20℃下静置过夜。

　　8、次日，在4℃下20,000×g离心10分钟，去上清。向沉淀加入1mL缓冲液A，重溶沉淀。（样品溶液）

　　9、将20uL样品溶液和标准溶液转移到另一个微量试管（500uL）中，加入24uL试剂混合物（使用前以1:5混合试剂A和试剂B），混合后， 100℃下加热微量试管30分钟。

　　10、冷却至室温，加入200uL缓冲液C，用涡流混合器混合。

　　11、将100μL溶液转移到96孔黑色孔板中，并在波长（例如：336nm em：383nm）实用荧光读板机测量荧光强度。
　　12、通过如下所示的连续稀释创建标准曲线。 通过这些点绘制平滑曲线以构建标准曲线。 通过标准曲线读取样品的浓度。
　　13、计算1g粪便中的粘蛋白含量。步骤（12）测得的值的50倍是1g粪中的粘蛋白含量。

Calibrator Number	Quantaity of Standard	Quantaity of Dilution Buffer	Final Concentration
1	500μl of Standard Solution	0	250μg/mL
2	500μl of Calibrator 1	500μl	125μg/mL
3	500μl of Calibrator 2	500μl	63μg/mL
4	500μl of Calibrator 3	500μl	31.5μg/mL
5	500μl of Calibrator 4	500μl	15.75μg/mL
6	500μl of Calibrator 5	500μl	7.875μg/mL
7	0	500μl	0

工作校准品：N-乙酰葡萄糖胺250μg/ mL
●　通过连续稀释创建标准曲线，如下图所示。
●　剩余的未稀释校准品应储存在2-10°C。
●　稀释校准品稳定，可在2-10°C保存1个月。

参考文献

［1］Susumu Honda,Yoshikazu Matsuda, Masaye Takahashi, and Kazuaki KakehiFluorimetric Determination of Reducing Carbohydrates with2-Cyanoacetamide and Application to Automated Analysis of Carbohydrates as Borate Complexes.(1980) Analytical Chemistry, Vol.52, No. 7

［2］Bovee-OudenhovenIM, Termont DS, Heidt PJ, et al.: Increasing the intestinal resistance of rats to the invasive pathogen Salmonella enteritidis: additive effects of dietary lactulose and calcium. Gut 40: 497-504, 1997.

［3］Crowther RS, Wetmore RF: Fluorometric assay of O-linked glycoproteins by reaction with 2-cyanoacetamide. Anal Biochem 163: 170-174, 1987.

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［5］YukakoOkazaki,HiroyukiTomotake, Kazuhisa Tsujimoto, Masahiro Sasaki,andNorihisa Kato. Consumption of a Resistant Protein, Sericin, Elevates Fecal Immunoglobulin A, Mucins, and Cecal Organic Acids in Rats Fed a High-Fat Diet. (2011) The Journal of Nutrition, 21, 10.3945/jn.111.144246.

［6］ZakiUtama,Yukako Okazaki, Hiroyuki Tomotake, Norihisa Kato, Tempe Consumption Modulates Fecal Secondary Bile Acids, Mucins, Immunoglobulin A, Enzyme Activities, and CecalMicroflora and Organic Acids in Rats. Foods Hum Nutr(2013) 68:177-183