PURExpress® 体外蛋白合成试剂盒 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

PURExpress® 体外蛋白合成试剂盒是新型无细胞转录/翻译体系，用于基因快速表达分析，是由大肠杆菌翻译所必需组份纯化而构成。PURExpress 体系无核酸酶和蛋白酶的污染，保护了 DNA 和 RNA模板/复合体，避免了蛋白的修饰及降解。转录和翻译过程仅需将两管试剂混合，一步反应即可完成，几个小时内即可获得实验结果，PURExpress 体系大大地节省了宝贵的实验时间，是用于高通量技术的理想选择。

PURExpress 文献引用

图 1：使用 PURExpress® 体外蛋白合成试剂盒的表达蛋白 PURExpress® 体外蛋白合成试剂盒 |
在 25 μl 反应体系中加入 250 ng 模板 DNA 和 20 单位 RNase 抑制剂，37℃ 温育 2 小时。各取 2.5 μl 反应液使用 10 – 20% Tris-甘氨酸凝胶进行 SDS-PAGE 电泳分析。红点处指示为目的蛋白。Marker M 是蛋白质分子量标准（NEB #P7703 已停产，被 NEB #P7717 替代）。
图 2：添加 35S-甲硫氨酸通过放射自显影显示蛋白 PURExpress® 体外蛋白合成试剂盒 |
在 25 μl 反应中加入 250 ng 模板 DNA、20 单位 RNase 抑制剂以及 2 μl 35S-甲硫氨酸，37℃ 温育 2 小时。各取 2.5 μl 反应液进行 SDS-PAGE 电泳分析，将凝胶固定 10 分钟，80℃干燥 2 小时，并在 -80℃ 条件下使用 x 射线胶片曝光 5 小时。
图 3：使用 PURExpress 体系进行蛋白质合成和纯化示意图PURExpress® 体外蛋白合成试剂盒 |
图 4：使用 PURExpress 体系表达和反向纯化 DHFR（A）和 T4 DNA 连接酶（B） PURExpress® 体外蛋白合成试剂盒 |
根据随附产品说明书中的建议，使用 125 μl 的反应体系。样本使用经考马斯亮蓝染色的 10 – 20% Tris-甘氨酸凝胶进行分析。在这两种情况下，目的蛋白都可以在总蛋白质的条带中可见。红点处指示为目的蛋白。Marker M 是蛋白质分子量标准（NEB# P7703 已停产，被 NEB #P7717 替代）。
产品类别:
PURExpress,
Cell-Free Protein Expression Products,
Protein Expression Products

应用:
PURExpress,
Toxic Protein Expression,
Cell-Free Protein Expression,

High-throughput cloning and automation solutions,
Expression of Difficult Proteins,
Disulfide-bonded Protein Expression,

Protein Expression

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E6800S     -80    
        PURExpress Solution A B0228AVIAL -80 1 x 0.1 ml 2.5 X
        Solution B (75 μl) P0760AVIAL -80 1 x 0.075 ml Not Applicable
        PURExpress Control DHFR Plasmid N0424AVIAL -20 1 x 0.01 ml 125 ng/µl
    • E6800L     -80    
        PURExpress Solution A B0228AVIAL -80 10 x 0.1 ml 2.5 X
        Solution B (75 μl) P0760AVIAL -80 10 x 0.075 ml Not Applicable
        PURExpress Control DHFR Plasmid N0424AVIAL -20 1 x 0.01 ml 125 ng/µl

  • 优势和特性

    应用特性

    • 快速合成用于蛋白质特性研究的分析量级别的样本
    • 确认开放阅读框
    • 检测突变对 ORF 的影响
    • 合成具有活性和功能域的截短蛋白
    • 掺入修饰的、非天然的或标记的氨基酸
    • 绘制抗原表位图谱
    • 毒性蛋白表达
    • 核糖体展示
    • 翻译和/或蛋白折叠研究
    • 体外区域化

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  • 注意事项

    1. 提供 125 ng/µl 的对照（DHFR）模板。使用 2 µl 模板进行阳性对照反应。模板 DNA，特别是通过质粒小提制备的 DNA（如 Qiagen）通常是 RNase 酶污染的主要来源。我们强烈建议在每个反应中加入 20 单位的小鼠 RNase 抑制剂（NEB #M0314）。
    2. PURExpress DHFR 对照模板序列文件：Fasta GenBank
    3. 贮存条件：试剂盒所有组份必须贮存于 -80℃。
    4. 将溶液 B 加入溶液 A 中，不要在未缓冲的情况下稀释溶液 B。我们建议 25 μl 反应体系中模板 DNA 的起始量为 250 ng。可以通过建立多个反应并滴定加入不同起始量的 DNA，来确定模板 DNA 的最佳用量。通常情况下，每 25 μl 反应体系中，模板 DNA 最佳用量范围在 25 – 1000 ng 之间。

  • 参考文献

    1. Asahara, H. and Chong, S. (2010). In vitro genetic reconstruction of bacterial transcription initiation by coupled synthesis and detection of RNA polymerase holoenzyme. Nuc.Acid. Res.
    2. Desai, Bijoy J., Yuki Goto, Alessandro Cembran, Alexander A. Fedorov, Steven C. Almo, Jiali Gao, Hiroaki Suga, and John A. Gerlt (2014). Investigating the role of a backbone to substrate hydrogen bond in OMP decarboxylase using a site-specific amide to ester substitution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 201411772.
    3. Gu, Liangcai, Chao Li, John Aach, David E. Hill, Marc Vidal, and George M. Church (2014). Multiplex single-molecule interaction profiling of DNA-barcoded proteins. Nature.
    4. Gupta, Pulkit, Shanmugapriya Sothiselvam, Nora Vázquez-Laslop, and Alexander S. Mankin (2013). Deregulation of translation due to post-transcriptional modification of rRNA explains why erm genes are inducible. Nature communications. 4,
    5. Kaiser, Christian M., Daniel H. Goldman, John D. Chodera, Ignacio Tinoco, and Carlos Bustamante (2011). The ribosome modulates nascent protein folding. Science. 334 (6063), 1723-1727.
    6. Nakagawa, So, Stephen S. Gisselbrecht, Julia M. Rogers, Daniel L. Hartl, and Martha L. Bulyk (2013). DNA-binding specificity changes in the evolution of forkhead transcription factors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110(30), 12349-12354.
    7. Ramadoss, Nitya S., John N. Alumasa, Lin Cheng, Yu Wang, Sharon Li, Benjamin S. Chambers, Hoon Chang et al (2013). Small molecule inhibitors of trans-translation have broad-spectrum antibiotic activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110(25), 10282-10287.
    8. Rosenblum, Gabriel, and Barry S. Cooperman (2014). Engine out of the chassis: Cell-free protein synthesis and its uses. FEBS letters. 588(2), 261-268.
    9. Stafford, Ryan L., Marissa L. Matsumoto, Gang Yin, Qi Cai, Juan Jose Fung, Heather Stephenson, Avinash Gill et al (2014). In vitro Fab display: a cell-free system for IgG discovery. Protein Engineering Design and Selection. 27(4), 97-109.
    10. Tuckey, Corinna, Haruichi Asahara, Ying Zhou, and Shaorong Chong (2014). Protein Synthesis Using a Reconstituted Cell‐Free System. Current Protocols in Molecular Biology. 16-31.
    11. Weirauch, Matthew T., Atina Cote, Raquel Norel, Matti Annala, Yue Zhao, Todd R. Riley, Julio Saez-Rodriguez et al (2013). Evaluation of methods for modeling transcription factor sequence specificity. Nature biotechnology. 31(2), 126-134.
    12. Noto, T., Kurth, H., Kataoka, K., Aronica, L., DeSouza, L., Siu, K., Pearlman, R., Gorovsky, M. and Mochizuki, K. (2010). The tetrahymena argonaute-binding protein Giw1p directs a mature argonaute-siRNAcomplex to the nucleus. Cell. 140, 692-703.
    13. Tanner, D., Cariello, D., Woolstenhulme, C., Broadbent, M. and Buskirk, A. (2009). Genetic identification of nascent peptides that induce ribosome stalling. J. Biol.Chem. 284, 34809-34818.
    14. Talabot-Ayer, D., Lamacchia, C., Gabay, C., and Palmer, G. (2009). Interleukin-33 is biologically activeindependently of Caspase-1 cleavage. J. Biol.Chem. 284, 19420-19426.
    15. Feng, Y. and Cronan, J. E. (2009). A new memberof the Eschericia coli fad regulon: transcriptional regulation offadM (ybaW). J.Bacteriol. 191, 6320-6328.
    16. Solaroli, N., Panayiotou, C., Johansson, M., and Karlsson, A. (2009). Identification of two active functional domains of human adenylate kinase 5. FEBSLett. 283, 2872-2876.
    17. Arenz, Stefan, Haripriya Ramu, Pulkit Gupta, Otto Berninghausen, Roland Beckmann, Nora Vázquez-Laslop, Alexander S. Mankin, and Daniel N. Wilson (2014). Molecular basis for erythromycin-dependent ribosome stalling during translation of the ErmBL leader peptide. Nature communications. 5,
    18. Chong, Shaorong (2014). Overview of Cell‐Free Protein Synthesis: Historic Landmarks, Commercial Systems, and Expanding Applications. Current Protocols in Molecular Biology. 16-30.
    19. Daugherty, Ashley B., Sridhar Govindarajan, and Stefan Lutz (2013). Improved Biocatalysts from a Synthetic Circular Permutation Library of the Flavin-Dependent Oxidoreductase Old Yellow Enzyme. Journal of the American Chemical Society . 334 (38), 14425-14432.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Protein Synthesis Reaction using PURExpress (E6800)
    2. Analysis of Synthesized Protein using PURExpress (E6800)
    3. Determination of Protein Synthesis Yield with PURExpress (E3313, E6800, E6840, E6850)
    4. Purification of Synthesized Protein using Reverse His-tag Purification
    5. Measurement of 35S-Methionine Incorporation by TCA Precipitation and Yield Determination using PURExpress

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE6800_E3313_E6840_E6850

  • 应用实例

    • Use of the PURExpress® in vitro Protein Synthesis Kit, Disulfide Bond Enhancer and SHuffle® Competent E. coli for heterologous in vitro and in vivo cellulase expression.
    • Scaling down to scale up Miniaturizing cell free protein synthesis reactions with the Echo 525 Acoustic Liquid Handler

工具 & 资源

  • 选择指南

    • Protein Expression and Purification Selection Chart
    • PURExpress® vs. NEBExpress® Application Chart

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. When using PURExpress, I was unable to synthesize the control protein?
    2. When using PURExpress, I was able to synthesize the control protein, but the target sample is not present or present in low yield?
    3. When using PURExpress, I was able to synthesize the target protein, but full-length product is not major species?
    4. Where can I find many more detailed FAQs for PURExpress?
    5. Are there PURExpress citations?

  • 实验技巧

    在冰上融化试剂和建立反应体系
    使用前，请将溶液 A 和 B 充分混合。不要涡旋溶液 B 或核糖体，将其轻轻混合。
    溶液 A 可能呈浑浊白色。以均匀悬浮状态加入到反应中。
    在冰上按下列加样顺序建立反应体系：溶液 A、溶液 B、RNAse 抑制剂、水、模板 DNA 或 RNA
    建立反应体系后，要确保所有试剂都充分混合，可以轻柔地上下吸打混匀并进行短暂瞬时离心，37℃条件下温育 2 到 4 小时。