PURExpress® Δ (aa, tRNA) 试剂盒 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

PURExpress® 体外蛋白合成试剂盒是新型无细胞转录/翻译体系，用于基因快速表达分析，是由大肠杆菌翻译所必需组份纯化而构成。PURExpress 体系无核酸酶和蛋白酶的污染，保护了 DNA 和 RNA模板/复合体，避免了蛋白的修饰及降解。转录和翻译过程仅需将两管试剂混合，一步反应即可完成，几个小时内即可获得实验结果，PURExpress 体系大大地节省了宝贵的实验时间，是用于高通量技术的理想选择。

PURExpress 文献引用

图 1：使用 PURExpress® 体外蛋白合成试剂盒的表达蛋白。 PURExpress® Δ (aa, tRNA) 试剂盒 |
在 25 μl 反应体系中加入 250 ng 模板 DNA 和 20 单位 RNase 抑制剂，37℃ 温育 2 小时。各取 2.5 μl 反应液使用 10 – 20% Tris-甘氨酸凝胶进行 SDS-PAGE 电泳分析。红点处指示为目的蛋白。Marker M 是蛋白质分子量标准（NEB #P7703 已停产，被 NEB #P7717 替代）。

图 2： 添加 35S-甲硫氨酸通过放射自显影显示蛋白。
PURExpress® Δ (aa, tRNA) 试剂盒 |
在 25 μl 反应中加入 250 ng 模板 DNA、20 单位 RNase 抑制剂和 2 μl 35S-甲硫氨酸， 37℃ 温育 2 小时。各取 2.5 μl 反应液进行 SDS-PAGE 电泳分析，将凝胶固定 10 分钟， 80℃ 干燥 2 小时，并在 -80℃ 条件下使用 x 射线胶片曝光 5 小时。

图 3：使用 PURExpress 体系进行蛋白合成和纯化示意图。 PURExpress® Δ (aa, tRNA) 试剂盒 |
图 4：使用 PURExpress 体系表达和反向纯化 DHFR（A）和 T4 DNA 连接酶（B）。 PURExpress® Δ (aa, tRNA) 试剂盒 |
根据随附产品说明书中的建议，使用 125 μl 的反应体系。样本使用经考马斯亮蓝染色的 10 – 20% Tris-甘氨酸凝胶进行分析。在这两种情况下，目的蛋白都可以在总蛋白质的条带中可见。红点处指示为目的蛋白。Marker M 是蛋白质分子量标准（NEB #P7703 已停产，被 NEB #P7717 替代）。

产品类别:
PURExpress,
Cell-Free Protein Expression Products,
Protein Expression Products

应用:
PURExpress,
Cell-Free Protein Expression,
Protein Expression

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E6840S     -80    
        PURExpress Solution A (-aa, tRNA) B6841AVIAL -80 1 x 0.05 ml 5 X
        E. coli tRNA (25 μl) N6842AVIAL -80 1 x 0.025 ml Not Applicable
        Amino Acid Mix (25 μl) N6843AVIAL -80 1 x 0.025 ml Not Applicable
        Solution B P6840AVIAL -80 1 x 0.075 ml Not Applicable
        PURExpress Control DHFR Plasmid N0424AVIAL -20 1 x 0.01 ml 125 ng/µl

  • 特性和用法

    需要但不提供的材料

    • 一般条件：37℃温育
    • 标记：35S-甲硫氨酸（建议 > 1000 Ci/mmol，体外翻译级）
    • TCA 沉淀：TCA 溶液（25%、10%）、1 M NaOH、酪胺酸、乙醇、玻璃纤维过滤器、真空过滤歧管
    • SDS-PAGE：凝胶和电泳缓冲液、凝胶装置、电源、凝胶干燥器
    • 蛋白免疫印迹法：转移装置、膜、抗体和检测试剂
    • 纯化：Ni-NTA 琼脂糖、Amicon Ultra- 0.5 ml、Ultracel- 100K 膜离心过滤器

  • 优势和特性

    应用特性

    • 快速合成用于蛋白质特性研究的分析量级别的样本
    • 确认开放阅读框
    • 检测突变对 ORF 的影响
    • 合成具有活性和功能域的截短蛋白
    • 掺入修饰的、非天然的或标记的氨基酸
    • 绘制抗原表位图谱
    • 毒性蛋白表达
    • 核糖体展示
    • 翻译和/或蛋白折叠研究
    • 体外区域化

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    • E. coli 核糖体

  • 注意事项

    1. 阳性对照反应中，加入 2 μl 的对照（DHFR）模板以及氨基酸混合液和 tRNA 各 2.5 μl。
    2. 每个试剂盒提供的试剂足够进行 10 次反应（25 µl 反应体系/次）。
      该试剂盒单独提供氨基酸和 tRNA，用户可通过在反应中加入经修饰的氨基酸和 tRNA 混合液进行蛋白质合成反应。
    3. 将溶液 B 加入溶液 A 中，不要在未缓冲的情况下稀释溶液 B。我们建议 25  μl 反应体系中模板 DNA 的起始量为 250 ng 。可以通过建立多个反应并滴定加入不同起始量的 DNA，来确定模板 DNA 的最佳用量。通常情况下，每 25 μl 反应体系中，模板 DNA 的最佳用量范围在 25 – 1000 ng 之间。
    4. PURExpress DHFR 对照模板序列文件：Fasta、GenBank
    5. 提供 125 ng/μl 的对照（DHFR）模板。使用 2 μl 进行阳性对照反应。模板 DNA，特别是通过质粒小提制备的 DNA（如 Qiagen）通常是 RNase 酶污染的主要来源。我们强烈建议在每个反应中加入 20 单位的小鼠 RNase 抑制剂（NEB #M0314）。

  • 参考文献

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操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Protein Synthesis Reaction using PURExpress® ∆ (aa, tRNA) Kit (E6840)
    2. Analysis of Synthesized Protein using PURExpress (E6840)
    3. Measurement of 35S-Methionine Incorporation by TCA Precipitation and Yield Determination using PURExpress
    4. Determination of Protein Synthesis Yield with PURExpress (E3313, E6800, E6840, E6850)
    5. Purification of Synthesized Protein using Reverse His-tag Purification

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE6800_E3313_E6840_E6850

  • 应用实例

    • Scaling down to scale up Miniaturizing cell free protein synthesis reactions with the Echo 525 Acoustic Liquid Handler

工具 & 资源

  • 选择指南

    • Protein Expression and Purification Selection Chart

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. How is the Δ aa Δ tRNA Kit E6840S different from the PURExpress E6800S kit?
    2. When using PURExpress, I was unable to synthesize the control protein?
    3. When using PURExpress, I was able to synthesize the target protein, but full-length product is not major species?
    4. When using PURExpress, I was able to synthesize the control protein, but the target sample is not present or present in low yield?
    5. Where can I find many more detailed FAQs for PURExpress?
    6. Are there PURExpress citations?

  • 实验技巧

    在冰上融化试剂和建立反应体系
    使用前，请将溶液 A 和 B 充分混合。不要涡旋溶液 B 或核糖体，将其轻轻混合。
    溶液 A 可能呈浑浊白色。以均匀悬浮状态加入到反应中。
    在冰上按下列加样顺序建立反应体系：溶液 A、溶液 B、RNAse 抑制剂、水、模板 DNA 或 RNA
    建立反应体系后，要确保所有试剂都充分混合，可以轻柔地上下吸打混匀并进行短暂瞬时离心，37℃条件下温育 2 到 4 小时。