CpG 甲基转移酶（M.SssI） |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

CpG 甲基转移酶（M.SssI）能将双链二核苷酸识别序列 5´…CG…3´（1）中的所有胞嘧啶残基（C5）甲基化。

产品来源

CpG 甲基转移酶（M.SssI）分离自大肠杆菌菌株，该菌株携带克隆自螺原体（Spiroplasma）MQ1 菌株（2,3）的甲基转移酶基因。

产品类别:
Methyltransferases for Epigenetics Products,
Methyltransferases Products

应用:
Methylated DNA Analysis Products

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0226V     -20    
        CpG Methyltransferase (M.SssI) M0226VVIAL -20 1 x 12.5 µl 4,000 units/ml
        NEBuffer™ 2 B7002SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X
        S-adenosylmethionine (SAM) B9003SVIAL -20 1 x 0.1 ml 32 mM
    • M0226S     -20    
        CpG Methyltransferase (M.SssI) M0226SVIAL -20 1 x 0.025 ml 4,000 units/ml
        NEBuffer™ 2 B7002SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X
        S-adenosylmethionine (SAM) B9003SVIAL -20 1 x 0.1 ml 32 mM
    • M0226L     -20    
        CpG Methyltransferase (M.SssI) M0226LVIAL -20 1 x 0.125 ml 4,000 units/ml
        NEBuffer™ 2 B7002SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X
        S-adenosylmethionine (SAM) B9003SVIAL -20 1 x 0.1 ml 32 mM
    • M0226M     -20    
        CpG Methyltransferase (M.SssI) M0226MVIAL -20 1 x 0.025 ml 20,000 units/ml
        NEBuffer™ 2 B7002SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X
        S-adenosylmethionine (SAM) B9003SVIAL -20 1 x 0.1 ml 32 mM

  • 特性和用法

    单位定义

    1 个单位是指在 37℃ 条件下，20 μl 反应体系中，1 小时内能保护 1 μg λ DNA 不被 BstUI 限制性内切酶切割所需的酶量。

    反应条件

    1X NEBuffer™ 2
    Supplement with 160 µM S-腺苷甲硫氨酸（SAM）
    Incubate at 37°C

    1X NEBuffer™ 2
    50 mM NaCl
    10 mM Tris-HCl
    10 mM MgCl2
    1 mM DTT
    (pH 7.9 @ 25°C)

    对照保护实验

    在 20 μl 补充了 160 uM SAM 的 NEBuffer 2 中，1 μg Lambda DNA 和 1 个单位的 M.SssI 于 37℃ 温育 1 小时，后于 65℃ 热失活 15 分钟。添加含 10 个单位 BstU I 的 rCutSmart 缓冲液于 60℃ 温育 30 分钟，可用琼脂糖凝胶电泳测出 95% 的 DNA 被保护免于 BstU I 的切割。

    贮存溶液

    10 mM Tris-HCl
    1 mM EDTA
    200 µg/ml BSA
    50% Glycerol
    pH 7.4 @ 25°C

    热失活

    65°C for 20 minutes

  • 优势和特性

    应用特性

    • 抑制限制性内切酶切割
    • 研究 CpG 甲基化依赖性基因表达
    • 探究探针序列特异性与 DNA 大沟的相互作用
    • 改变 DNA 的物理特性
    • 统一 DNA 的 [3H]-标记
    • 减少限制性内切酶切割的位点数量，大幅提高酶的特异性

  • 相关产品

    单独销售的组分

    • NEBuffer 2
    • S-腺苷甲硫氨酸（SAM）

  • 注意事项

    1. 使用新鲜配置的 SAM 可优化甲基化反应。
    2. 无需 MgCl2 作为辅因子。Mg2+ 存在时，M.SssI 的甲基化变得分散而非连续进行，并且表现出拓扑异构酶活性（4）。
    3. 可使用含 50 mM NaCl、10 mM Tris-HCl（pH 7.9 @ 25℃）、10 mM EDTA、160 µM S-腺苷甲硫氨酸的缓冲液替代 NEBuffer 2。
    4. 4 小时后添加更多 SAM 可改善结果。不过，甲基化反应在很大程度上受 S-腺苷高半胱氨酸（SAH）（11）的影响。SAH 是甲基化反应的副产物，可比 SAM 更紧密地结合甲基化酶。SAH 的抑制作用大幅降低了反应速率。在更短的时间内使用更多的酶可改善甲基化反应。
      • 这种 CPG 甲基转移酶可用于研究高等真核生物体内胞嘧啶甲基化的功能，因为其特异性可模拟高等真核生物基因组中的修饰模式（5）。与哺乳动物酶（6,7）相反，CpG 甲基转移酶（2）能以相同效率甲基化未甲基化和半甲基化的 DNA 底物，使其成为修饰 DNA 的实用工具。
      • 若限制性内切酶的识别位点包含序列 CG 或二核苷酸的重叠序列，CpG 甲基转移酶可阻断这些内切酶的切割。值得注意的是，经 CpG 甲基转移酶甲基化的 DNA 在大肠杆菌中受到 Mcr 和 Mrr 限制，因此应用 Mcr– Mrr– 大肠杆菌转化。
      • 胞嘧啶残基的甲基化影响 DNA 的物理特性，包括降低 Z-DNA 形成的自由能（8）、增加 DNA 的螺旋程度（6），以及改变十字形突出的动力学特性（9）。由于化学测序过程（10）中对联氨的反应活性降低，5-甲基胞嘧啶的位置可因此确定。
      • 体外甲基化 DNA 应考虑 DNA 底物中 CpG 二核苷酸的高密度。例如，lambda DNA（48,502 bp）包含 3112 个 CpG 位点，因此 0.1 mg DNA/ml 溶液的甲基转移酶甲基受体位点为 19 µM。这一点非常重要，因为甲基供体 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的推荐浓度为 160 µM，超过受体位点的 8 倍。降低 DNA 浓度（< 0.02 mg/ml）有两个好处。首先，SAM 浓度仍然足够高，可驱动反应。其次，反应过程中产生的 S-腺苷-L-高半胱氨酸（AdoHcy）引起的潜在的最终产物抑制是有限的。
    6. SAM 贮存要求：S-腺苷甲硫氨酸以溶解在 0.005 M 硫酸和 10% 乙醇的 32 mM 溶液形式贮存于 –20℃。满足理想的贮存条件时，此溶液中的 SAM 可保持活性长达 6 个月。SAM 在 37℃，pH 7.5 的条件下不稳定；因此，当反应温育时间超过 4 小时，需补充 SAM。使用新鲜配置的 SAM 可以减轻实现完全酶切过程中遇到的许多问题。

  • 参考文献

    1. Renbaum, P. et al. (1990). Nucl. Acids Res. . 18, 1145-1152.
    2. Wu, J.C. and Santi, D.V. (1987). J.Biol. Chem. 262, 4778-4786.
    3. Nur, I. et al. (1985). J. Bacteriol.. 164,
    4. Forney, J.A. and Jack, W.E. (1991). NEB Transcript . 3(1), 5.
    5. Matsuo, K. et al. (1994). Nucl. Acids Res.. 22, 5354-5359.
    6. Doerfler, W. (1983). Ann. Rev. Biochem. . 52, 93-124.
    7. Gruenbaum, Y. et al. (1982). Nature. 295,
    8. Bestor, T.H. and Ingram, V.M. (1983). Proc. Natl. Acad. SCI. USA. 80, 5559-5563.
    9. Zacharias, W. et al. (1988). Biochemistry. 27, 2970-2978.
    10. Murchie, A.I. and Lilley, D.M. (1989). J. Mol.Biol. . 205, 593-602.
    11. Ohmori, H. et al. (1978). Nucl. Acids Res. 5, 1479-1485.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Recommended Protocol for 3H labeling of DNA
    2. Recommended Protocol for Methylation of Genomic DNA

  • 使用指南

    • Activity of DNA Modifying Enzymes in rCutSmart™ Buffer
    • Effects of CpG Methylation on Restriction Enzyme Cleavage

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Is S-adenosylmethionine (SAM) supplied with the Methyltransferase?
    2. What should be considered if the methylation using SssI Methyltransferase is not going to completion?
    3. What is the activity of SssI Methyltransferase in other NEBuffers, including rCutSmart?
    4. Can the SssI Methyltransferase methylate single stranded DNA?
    5. Can SssI Methyltransferase be used for generating a positive control for methylation-specific PCR or bisulfate sequencing?
    6. What is the specific activity of SssI Methyltransferase?
    7. Does SssI Methyltransferase require magnesium in the buffer?
    8. Can DNA be radiolabeled with SssI Methyltransferase?
    9. Can SssI methylated DNA be used to transform E. coli?
    10. What is the molecular weight of SssI (CpG) Methyltransferase?
    11. Will any NEB methyltransferases (methylases) work on RNA?

  • 实验技巧

    务必在即将进行甲基化反应前才将 SAM 添加到反应缓冲液中，因为 SAM 在水溶液中不稳定。-20℃ 冷冻贮存 SAM 可延长其保质期；新鲜配置的 SAM 对实现最佳甲基化反应很重要。