EnGen® Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶为 EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶的高保真突变体，基因克隆自化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes），含有 4 个突变位点（N497A/R661A/Q695A/Q926A），可显著减少 DNA 的非特异性切割。Spy Cas9 核酸酶是一种由 RNA 引导的核酸内切酶，可在靶向位点特异切割双链 DNA。单向导 RNA（sgRNA）将 Cas9 靶向 5´-NGG-3´ PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列上游的区域，并在 PAM 上游的第 3 个碱基外进行双链切割（1）。EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶蛋白的 N 端和 C 端都含有猴病毒 40（SV40）T 抗原核定位序列（NLS）。

图 1：sgRNA 引导Spy Cas9 核酸酶切割靶标 DNA 示意图

EnGen® Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶 |

S. pyogenes Cas9 (Spy Cas9) 蛋白以米色显示，sgRNA 以蓝色显示，DNA 以灰色、绿色和红色显示。DNA 靶标以及前间隔序列以绿色显示，图中 R-loop 区域展示了靶标序列与向导 RNA 互补配对。Cas9 与 DNA 结合所需的 PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列以红色显示，以黑色三角标注 DNA 的切割位置。橙色标签标注了 Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶（2）中突变氨基酸的相对位置，这些突变氨基酸与靶标 DNA 的结合位点位于 RNP-DNA 复合物中 PAM 的远端区域。

图 2：EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶和 EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶针对于三个不同靶基因的编辑效率和脱靶率

EnGen® Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶 |

通过二代测序技术确定 EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶的保真度。首先在 Nucleofector 核转染系统中预制 RNP 复合物，Cas9 浓度为 2 μM，sgRNA 浓度为 4 μM；然后将 EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶（野生型）和 EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶的 RNPs 复合物电转入 1×105 HEK293 细胞中，靶向位点为 EMX1 (A)、FANCF (B) 和 ZSCAN2 (C)（2）。电穿孔后 48–72 小时，从电穿孔细胞中提取基因组 DNA，并对靶基因和之前用 GUIDESeq （2） 鉴定的 7 种脱靶位点进行 PCR 扩增 DNA。使用 NEBNext® Ultra™ II DNA 文库制备试剂盒和 NEBNext 多样本接头引物试剂盒，将扩增产物构建为 Illumina® 测序文库。使用 CRISPResso 2（3）分析测序数据。结果分别展示了 EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶（野生型）、EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶和非靶向对照对靶向位点和 7 个脱靶位点（1–4 个碱基替换）切割比例。图中列出了每个靶基因序列，其中 PAM 以金色框表示，与脱靶相关的碱基替换位点以绿色框表示，如果碱基替换发生在 PAM 序列的可变区，则以灰色框表示。该测试设置 3 个平行试验。误差线表示标准差。

图 3：体外实验中显示，EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶对 DNA 靶标中的碱基替换更加敏感

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比较使用 EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶和 EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶时，向导 RNA 序列与靶标 DNA 序列结合的错配容忍度。首先对完全匹配的靶序列进行改造，使其包含 1-2 个碱基替换、插入、缺失，或者相对于标准 PAM 序列包含 1 个碱基替换，然后分别使用 EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶和 EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶对其进行切割，37℃ 孵育 1 小时。以切割后的 DNA 为模板 PCR 扩增 5 个循环，添加测序接头，再进行 Illumina 测序。每个序列的丰度除以未被 Cas9 切割的 DNA 池序列的丰度，该比例以 log2 标度绘制。该值 ≥0.0 表示序列未被 Cas9 切割，＜0.0 表示被 Cas9 切割。将上述 log2 值以热点图形式绘制，横轴对应碱基替换的位置和类型，蓝点高度对应 log2 值。

图 4：体外实验中显示，EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶对 DNA 靶标中的碱基插入更加敏感

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比较使用 EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶和 EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶时，向导 RNA 序列与靶标 DNA 序列结合的错配容忍度。首先对完全匹配的靶序列进行改造，使其包含 1-2 个碱基替换、插入、缺失，或者相对于标准 PAM 序列包含 1 个碱基替换，然后分别使用 EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶和 EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶对其进行切割，37℃ 孵育 1 小时。以切割后的 DNA 为模板 PCR 扩增 5 个循环，添加测序接头，再进行 Illumina 测序。每个序列的丰度除以未被 Cas9 切割的 DNA 池序列的丰度，该比例以 log2 标度绘制。该值 ≥0.0 表示序列未被 Cas9 切割，＜0.0 表示被 Cas9 切割。结果图中，X 轴为碱基插入位置，Y 轴为 log2 值 对于单碱基差异序列，每个位置的插入碱基类型用彩色圆点表示。

图 5：体外实验中显示，EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶对 DNA 靶标中的碱基缺失更加敏感

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比较使用 EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶和 EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶时，向导 RNA 序列与靶标 DNA 序列结合的错配容忍度。首先对完全匹配的靶序列进行改造，使其包含 1-2 个碱基替换、插入、缺失，或者相对于标准 PAM 序列包含 1 个碱基替换，然后分别使用 EnGen Spy Cas9 NLS 核酸酶和 EnGen Spy Cas9 HF1 高保真核酸酶对其进行切割，37℃ 孵育 1 小时。以切割后的 DNA 为模板 PCR 扩增 5 个循环，添加测序接头，再进行 Illumina 测序。每个序列的丰度除以未被 Cas9 切割的 DNA 池序列的丰度，该比例以 log2 标度绘制。该值 ≥0.0 表示序列未被 Cas9 切割，＜0.0 表示被 Cas9 切割。结果图中，X 轴为碱基缺失位置，Y 轴为 log2 值 对于单碱基差异序列，每个位置的缺失碱基类型用彩色圆点表示。

 

产品来源

An E. coli strain that carries the cloned Cas9 gene from Streptococcus pyogenes with N- and C-terminal Simian virus 40 (SV40) T antigen nuclear localization signal (NLS) and a N-terminal 6XHis tag.

产品类别:
Programmable Nucleases Products

应用:
Genome Editing Applications

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0667M     -20    
        EnGen® Spy Cas9 HF1 M0667MVIAL -20 1 x 2,500 pmol 20 µM
        NEBuffer™ r3.1 B6003SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X
    • M0667T     -20    
        EnGen® Spy Cas9 HF1 M0667TVIAL -20 1 x 500 pmol 20 µM
        NEBuffer™ r3.1 B6003SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X

  • 特性和用法

    反应条件

    1X NEBuffer™ r3.1
    Incubate at 37°C

    1X NEBuffer™ r3.1
    100 mM NaCl
    50 mM Tris-HCl
    10 mM MgCl2
    100 µg/ml Recombinant Albumin
    (pH 7.9 @ 25°C)

    贮存溶液

    300 mM NaCl
    10 mM Tris-HCl
    0.1 mM EDTA
    1 mM DTT
    50% Glycerol
    pH 7.4 @ 25°C

    热失活

    65°C for 5 minutes

  • 注意事项

    1. 20 µM 等于 3.22 mg/ml

  • 参考文献

    1. Jinek M. et al (2012). Science. 816-821. DOI: 10.1126/Science.1225829. Epub 2012 Jun 28 PubMedID: 22745249
    2. Kleinstiver, B.P. and Pattanayak, V., et al. (2016). Nature. 529, 490-495.
    3. Clement, K., et al. (2019). Nat Biotechnol . 37, 224-226.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. In vitro digestion of DNA with EnGen® Spy Cas9 HF1 (NEB #M0667)
    2. Electroporation of EnGen® Spy Cas9 HF1 (NEB #M0667) into adherent cells using the Lonza 4D-Nucleofector™ System
    3. Transfection of EnGen® Spy Cas9 HF1 (NEB #M0667) into adherent cells using the Lipofectamine® RNAiMAX System
    4. Electroporation of EnGen® Spy Cas9 HF1 (NEB #M0667) into adherent cells using the Neon® Electroporation System
    5. In vitro digestion of plasmid DNA with EnGen SpRY Cas9 (NEB #M0669)

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Where is the nuclear localization signal on EnGen® Spy Cas9 HF1 located?
    2. Which nuclear localization signal is fused to EnGen® Spy Cas9 HF1?
    3. What is the difference between EnGen® Spy Cas9 HF1 and EnGen Spy Cas9 NLS (NEB #M0646)?
    4. Why do I observe incomplete digestion/editing with EnGen® Spy Cas9 HF1?
    5. Why does digestion/editing efficiency differ between two different guide RNAs?
    6. Does NEB provide plasmids for gRNA cloning?
    7. How do I dilute the enzyme to 1 μM for in vitro reactions?
    8. Can you tell me more about the switch from BSA to Recombinant Albumin (rAlbumin) in NEBuffers?