PCR 克隆试剂盒 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

PCR 克隆试剂盒提供优化的克隆预混液（其中配有专有的连接增强剂）和线性载体。该线性载体利用独特的机制抑制背景菌落生长，使背景值降为最低。本试剂盒能简单、快速克隆各种 PCR 产物，包括具有校读功能的聚合酶产生的平末端扩增子（如：Q5®）和无校对功能的聚合酶产生的单碱基突出末端扩增子（如 Taq 或 Taq 预混液：OneTaq®、LongAmp® Taq）。克隆预混液中包含有末端修复成份，可在连接反应步骤前进行末端平齐化，因此，无论扩增子是何种末端都能完成有效连接。此外，使用本试剂盒，PCR 产物无需纯化，PCR 引物也无需经过 5´-磷酸基团修饰。有关试剂盒的工作原理，请观看视频。

具有极强的灵活性：无论有没有 5´ 磷酸、是否进行纯化，任何 DNA 聚合酶制备的扩增子都能进行克隆！

无背景或背景很少的 PCR 克隆PCR 克隆试剂盒 |
根据推荐的操作流程，将 500 bp PCR 产物与线性化载体以 3:1 的比例一起温育。取 2 μl 反应物加入为转化提供的 NEB 10-beta E. coli 感受态细胞，取 1/20 复苏菌液涂板。左边平板为对照（仅有载体骨架），右边平板包含 PCR 插入片段。
克隆试剂盒操作流程PCR 克隆试剂盒 |
pMiniT 2.0 载体图谱PCR 克隆试剂盒 |
上图是不含插入片段时的载体图谱。唯一的酶切位点用黑色字表示。其它用于亚克隆的酶切位点用红色字表示。底部的扩展框标明了用于 PCR 或测序分析的引物位置，亚克隆或体外转录线性化的酶切位点，及毒性小基因内插入片段的位置。
产品类别:
DNA Assembly, Cloning and Mutagenesis Kits Products

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E1202S     Multi-temperature    
        Linearized pMiniT™ 2.0 Vector N0312AVIAL -20 1 x 0.02 ml 25 µg/ml
        Cloning Analysis Forward Primer S1512AVIAL -20 1 x 0.035 ml 100 µM
        Cloning Analysis Reverse Primer S1513AVIAL -20 1 x 0.035 ml 100 µM
        Amplicon Cloning Control N0555AVIAL -20 1 x 0.01 ml 15 µg/ml
        pUC19 Vector N3041AVIAL -20 1 x 0.025 ml 50 pg/µl
        Cloning Mix 1 M1015AVIAL -20 1 x 0.08 ml 2.5 X
        Cloning Mix 2 M1016AVIAL -20 1 x 0.02 ml 10 X
        NEB® 10-beta/Stable Outgrowth Medium B9035SVIAL 4 1 x 25 ml Not Applicable
        NEB® 10-beta Competent E. coli (Cloning Efficiency) C3018AVIAL -80 20 x 0.05 ml Not Applicable

  • 特性和用法

    存储注意事项

    • The kit is shipped on dry ice. Upon arrival, store the competent cells (in the large exterior box) at -80°C, the components in the small interior box at -20°C and the NEB™ 10-beta/Stable Outgrowth Medium at room temperature or 4°C.

  • 优势和特性

    Features

      • 含 SP6 和 T7 启动子，便于体外转录
      • 从含氨苄青霉素抗性的基因中去除 BsaI 位点（便于 Golden Gate 克隆）
      • 可以轻松克隆所有类型的 PCR 产物，包括平末端和 TA 末端
      • 克隆速度快，连接仅需 5 分钟
      • 筛选简单，几乎没有克隆背景，不需要蓝白斑筛选
      • 无需纯化步骤，节约时间
      • 两侧的限制性内切酶酶切位点方便亚克隆，包含两种单酶切选择
      • 提供分析引物，便于进行下游菌落 PCR 筛选或测序
      • 试剂盒包含 1 kb 对照扩增子和线性载体及一次用量的 E. coli 感受态细胞
      • 比其它商业化产品保质期长（12 个月）

    • 相关产品

      相关产品

      • Quick-Load® 紫色 1 Kb Plus DNA Ladder
      • LongAmp® Taq 2X 预混液
      • OneTaq® 2X 预混液（提供标准缓冲液）
      • LongAmp® Taq DNA 聚合酶
      • OneTaq® DNA 聚合酶
      • dNTP 混合液
      • NEB® 10-beta E. coli 感受态细胞（高效级）
      • e2065-hiscribe-t7-arca-mrna-kit
      • e2060-hiscribe-t7-arca-mrna-kit-with-tailing
      • e2050-hiscribe-t7-quick-high-yield-rna-synthesis-kit
      • e2040-hiscribe-t7-high-yield-rna-synthesis-kit
      • SP6 RNA 聚合酶
      • m0251-t7-rna-polymerase
      • rNTP 混合液
      • 小鼠 RNase 抑制剂
      • m0307-rnase-inhibitor-human-placenta

    • 注意事项

      1. NEB PCR 克隆试剂盒包含的试剂足以进行 20 次 10 μl 的克隆反应。试剂盒还提供引物，便于进行下游菌落 PCR 筛选和/或测序。
         

    • 参考文献

      1. Wang, Y. et al. (2004). Nucleic Acids Research. 32, 1197-1207.
      2. Heurgue-Hamard, V. et al. (2000). The EMBO Journal. 19, 2701-2709.
      3. Tenson, T. et al. (1999). Journal of Bacteriology. 181, 1617-1622.

    操作说明、说明书 & 用法

    • 操作说明

      1. Ligation Protocol for NEB PCR Cloning Kit
      2. Transformation Protocol for NEB PCR Cloning Kit
      3. Plating Protocol for NEB PCR Cloning Kit
      4. Insert Screening Protocols for NEB PCR Cloning Kit
      5. RNA Synthesis of Cloned Insert Transcripts

    • 说明书

      产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

      • manualE1202_E1203

    • 使用指南

      • NEB PCR Cloning Kit (NEB #E1202/E1203) Tips
      • Tips for the Monarch PCR & DNA Cleanup Kit

    FAQs & 问题解决指南

    • FAQs

      1. How does the NEB® PCR Cloning Kit work?
      2. How can the cloning vector work with both blunt-ended amplicons and single-base overhang-containing amplicons?
      3. Do these polishing components present in the master mix affect my cloning efficiency if my insert already has blunt ends?
      4. Do my inserts have to possess 5´ phosphates?
      5. Can the cloning kit be used for inserts that are not necessarily PCR amplicons?
      6. Can the cloning kit be used with inserts containing 5´ or 3´ overhangs greater than the single-base overhang achieved by PCR with Taq DNA polymerase?
      7. Can I use the NEB PCR Cloning Kit featuring pMiniT 2.0 for Golden Gate Assembly?
      8. Does the PCR product need to be purified?
      9. Can I use a different competent E. coli strain than the provided NEB 10-beta strain?
      10. How can I maximize the number of transformants?
      11. Can I scale down the reactions to use less vector?
      12. Are there limits regarding the size of inserts that can be cloned?
      13. Are the NEB 10-beta Competent E. coli (Cloning Efficiency) provided in the kit the same cells as NEB 10-beta Competent E. coli (High Efficiency)?
      14. How can I determine if my NEB 10-beta cells are competent?
      15. Can Cloning Mix 1 and Cloning Mix 2 be mixed together before adding them to the ligation reaction?
      16. Where are the +1 transcription positions for the SP6 and T7 promoters for in vitro transcription and translation located?
      17. What is the difference between the original pMiniT and the pMiniT 2.0 linearized vector backbone now provided in the kit?

    • 实验技巧

      1. 插入片段和载体的比例为 3:1：插入片段与载体的比例越高，所得菌落会越少。这是因为插入片段可能连接到载体的两端，从而阻碍对扩增子插入片段的克隆。

      2. 操作流程：此操作流程经全面优化，背景很少。如果无意中偏离了操作流程（例如，延长连接温育时间、过度浓缩复苏菌液），可以通过用较少的复苏菌液（< 50 µl）涂板改善；涂板时使用太多的细胞可能会增加背景，并导致菌落 PCR 出现问题。如果需要更多菌落，请将 50 µl 复苏菌液涂布到多个平板上。

      3. 终止连接反应很重要：如果您希望将连接反应液贮存起来，以便过一段时间进行转化实验，请确保您的冰箱温度足够低（-20℃），可以将连接反应液冻起来。或者，可用干冰/酒精浴快速冷冻样本，然后将样本转移到 -20℃ 条件下。如果冷冻贮存的连接样本仍保持液态，这可能导致载体骨架发生进一步低水平的连接。这种情况下，可以使用更少的复苏菌液（< 50 µl）涂板。

      4. 不要在室温下孵育转化平板。室温下细胞生长速度缓慢，会增加背景菌落的数量。

      5. 最后将克隆预混液 1 和 2 添加到反应体系中。如果试图通过制备水、连接预混液和 pMiniT 的混合液，然后将其分装，再添加 DNA 插入片段来节省时间。这会让 pMiniT 重新环化，从而导致克隆效率降低，因为连接在添加扩增子之前已开始。