uilder® 高保真 DNA 组装克隆试剂盒 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

uilder® 高保真 DNA 组装克隆试剂盒 |

NEBuilder 高保真 DNA 组装克隆试剂盒可以高效、准确地组装 DNA 片段。不管片段的长短和末端匹配性如何，该方法都可以无缝组装多个 DNA 片段。还可以组装单链寡核苷酸或含 15-30 bp 重叠区的不同片段长度的 DNA 片段。此方法操作简单、灵活，以预混液形式提供，主要用于合成生物学和多片段的一步克隆。在同一反应缓冲液中有几种不同的酶活性（见图 1）：

  • 核酸外切酶活性会产生单链 3´ 突出末端，促使互补的末端重复序列（重叠区）退火
  • 聚合酶活性会填补退火片段的缺口
  • DNA 连接酶活性能在组装后的 DNA 切刻处进行连接

最终形成双链闭合的 DNA 分子，可作为 PCR、RCA 的模板或其它分子生物学应用，包括直接转化大肠杆菌。NEBuilder 高保真 DNA 组装克隆试剂盒随附 NEB 5-alpha E.coli 感受态细胞（高效级）。

NEBuilder 高保真 DNA 组装试剂盒提供多种剂型：含 NEB 5-alpha 化学感受态细胞（克隆试剂盒，NEB #E5520），含 NEB 10-beta 化学感受态细胞（大片段组装试剂盒，NEB #E2623）；以及不含感受态细胞（预混液，NEB #E2621）。NEB 5-alpha 化学感受态细胞适用于小于等于 15 kb 片段的常规组装。对于大于 15 kb 的组装，NEB 建议使用 NEB 10-beta E. coli 感受态细胞（高效级，NEB #C3019）或 NEB 10-beta E. coli 电转感受态细胞（NEB #C3020）。如果组装基因包含重复序列，应使用 NEB Stable E. coli 感受态细胞（NEB #C3040）。

NEBuilder 的应用：

  • 定点突变
  • sgRNA-Cas9 表达载体构建 | 视频
  • 线性酵母表达框组装

为帮助您选择最佳 DNA 组装方法，请参考合成生物学/DNA 组装选择指南。

如需帮助设计用于 NEBuilder 的引物，请观看引物设计视频。

图 1：不同于一般的 DNA 组装试剂

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图 2：NEBuilder 高保真 DNA 组装方法概述

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图 3：NEBuilder 高保真 DNA 组装提高了 4 个片段组装反应的效率

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使用 NEBuilder 高保真 DNA 组装预混液（NEB #E2621）、GeneArt® Gibson 组装®混合液（Thermo Fisher #A46627）和 In-Fusion® Snap 组装预混液（Takara Bio USA #638947），组装具有 20 bp 重叠的四个片段（约 20 fmol），构建 pUC19 载体。在 50℃ 下进行组装反应，反应时间为 60 分钟或 15 分钟。将 2 μl 的每种组装后的混合物转化到 NEB 5-alpha E.coli 感受态细胞（NEB #C2987）中，并涂布到含 IPTG 和 X-Gal 的 LB/Amp 平板上。统计代表正确组装的蓝色菌落数（> 总菌落的 95%）。NEBuilder 高保真 DNA 组装预混液得到的菌落数多于两种竞品。

查看与 GeneArt Gibson 组装预混液和 In-Fusion Snap 组装预混液对比的其它性能数据

产品类别:
DNA Assembly, Cloning and Mutagenesis Kits Products

应用:
NEBuilder® HiFi DNA Assembly,
Genome Editing Applications

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E5520S     Multi-temperature    
        NEBuilder® Positive Control N2611AVIAL -20 1 x 0.05 ml Not Applicable
        pUC19 Vector N3041AVIAL -20 1 x 0.025 ml 50 pg/µl
        NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) C2987HVIAL -80 10 x 0.05 ml Not Applicable
        SOC Outgrowth Medium B9020SVIAL 4 1 x 25 ml Not Applicable
        NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix M5520AVIAL -20 1 x 0.1 ml 2 X

  • 特性和用法

    需要但不提供的材料

    DNA 聚合酶（用于制备 PCR 产物）：
    建议使用 Q5® 超保真 DNA 聚合酶（NEB #M0491）或相关产品，例如 Q5 热启动超保真 DNA 聚合酶（NEB #M0493）或 Q5 热启动超保真 2X 预混液（NEB #M0494），来制备 PCR 产物。

    建议在 LB（Luria-Bertani）平板添加适合的抗生素。为了筛选成功转化的感受态细胞，我们建议使用添加了适合的抗生素的 LB 平板。

  • 优势和特性

    Features

    与 GeneArt Gibson 组装预混液和 In-Fusion Snap 组装预混液相比，具有更多的优势：

    • 组装后保真度高、正确率高，无需反复筛选、测序。
    • 更高效地连接 DNA 片段，轻松应对更大片段或较低 DNA 起始量的组装
    • 由于可去除 5´ 和 3´ 末端的不匹配序列，NEBuilder 高保真产品可进行连续组装。（省去耗时的 PCR 扩增步骤，节省时间）
    • 使用合成的单链 DNA 寡核苷酸桥式连接两个双链 DNA 片段（如接头插入或 gRNA 建库），构建简单又快速
    • 适用于较低的 DNA 起始量要求
    • NEBuilder 高保真产品可兼容使用 Gibson 组装® 预混液和 In-Fusion 组装预混液设计的片段，因此可轻松地从其它体系转用 NEBuilder 高保真产品
    • 使用 NEBuilder 产品，无需缴纳授权费

    超越传统克隆的优势：

    • 便捷快速的无缝克隆有助于节省时间
    • 一个系统既可用于“标准长度”片段的组装，也可用于大片段的组装，片段最多可达 11 个。
    • 无需改动现有实验流程，DNA 可立即进行转化，或作为 PCR 或 RCA 的模板。
    • 适用性强，适用于各种 DNA 改造，包括定点突变。

  • 相关产品

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    • Monarch® DNA 胶回收试剂盒
    • Monarch® PCR & DNA 纯化试剂盒（5 μg）

  • 注意事项

    1. 收到货后，请将试剂盒贮存于 –80℃。使用之前，将预混液融化并充分涡旋混匀，然后将其置于冰上。第一次使用后，将高保真 DNA 组装预混液和阳性对照贮存于 –20℃，SOC Outgrowth 培养基贮存于室温。感受态细胞贮存于 –80℃。
    2. 为确保成功组装以及后续成功转化组装的 DNA，NEB 建议遵循以下做法：

      DNA：如果所有 PCR 产物的总体积不超过组装反应体积的 20%，无需进行 PCR 产物纯化。PCR 产物体积过多会引入更多 PCR 产物中存在的 PCR 反应缓冲液和未使用的引物，从而降低高保真 DNA 组装和转化的效率。PCR 产物柱纯化可能会使高保真 DNA 组装和转化的效率增加 2–10 倍，在组装三个或更多 PCR 片段时，或组装长度超过 5 kb 的片段时，强烈建议进行 PCR 产物柱纯化。用于组装的纯化 DNA 可溶于 ddH2O（推荐使用 Milli-Q® 水或同等纯度的水）、TE 或其它稀释缓冲液。

    3. 插入片段：直接将片段组装到克隆载体中时，组装片段的浓度应比载体浓度高至少 2 倍。要将 4 个或更多片段组装到载体中，建议使用等摩尔比例的片段。

    4. 转化：NEBuilder 高保真 DNA 组装克隆试剂盒随附 NEB 5-alpha E. coli 感受态细胞（高效级，NEB #C2987），适用于小于等于 15 kb 组装产物的转化。也可使用除 BL21、BL21(DE3)、Lemo21(DE3)、Nico21(DE3) 和 SHuffle® 外的其它 NEB E. coli 感受态细胞。使用 NEB 以外的供应商的 E. coli 感受态细胞时，高保真 DNA 组装产物转化的稳定性会降低。
    5. 电转化：电转化可以将转化效率提高几个数量级。使用 NEBuilder 高保真 DNA 组装预混液时，取 1 μl 组装产物用于电转化，并将多种稀释度的菌液涂布到平板上。

      如果需要使用电转感受态细胞，请遵守“电转感受态细胞转化操作流程”

    6. 生物学特性：一些 DNA 结构，包括反向重复序列和串联重复序列，会被大肠杆菌选择性丢失。大肠杆菌无法耐受某些重组蛋白，因此可能会导致转化效率较低或菌落较小。

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. NEBuilder® HiFi DNA Assembly Electrocompetent Transformation Protocol
    2. NEBuilder® HiFi DNA Assembly Chemical Transformation Protocol (E2621, E5520, E2623)
    3. NEBuilder HiFi DNA Assembly Reaction Protocol
    4. NEBuilder Assembly of a PCR Fragment
    5. Protocol for cloning DNA containing repeat elements (C3040)
    6. Protocol for Bridging double-stranded DNA with a single-stranded DNA oligo using NEBuilder HiFi DNA Assembly (NEB #E2621)
    7. Protocol for assembling annealed DNA oligonucleotides and a double-stranded DNA vector using NEBuilder HiFi DNA Assembly (NEB #E2621)

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE2621_E5520

  • 使用指南

    • Guidelines for using NEBuilder® HiFi DNA Assembly
    • Optimization Tips for NEBuilder® HiFi DNA Assembly and NEB® Gibson Assembly

  • 应用实例

    • Improved methods for site-directed mutagenesis using NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix
    • Construction of an sgRNA-Cas9 expression vector via single-stranded DNA oligo bridging of double-stranded DNA fragments
    • Improved method for assembly of linear yeast expression cassettes using NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix
    • Bridging dsDNA with a ssDNA Oligo and NEBuilder® HiFi DNA Assembly to create an sgRNA-Cas9 Expression Vector
    • Nanoliter Scale DNA Assembly Utilizing the NEBuilder® HiFi Cloning Kit with the Labcyte® Echo® 525 Liquid Handler

工具 & 资源

  • 选择指南

    • Synthetic Biology/DNA Assembly Selection Chart

  • Web 工具

    • NEBioCalculator®
    • NEBuilder® Assembly Tool
    • NEBuilder® Protocol Calculator

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. I am not sure whether to choose NEBuilder HiFi DNA Assembly or NEB Gibson Assembly? How are the products different?
    2. What are the advantages of this method compared to traditional cloning methods?
    3. Are there any differences between NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix and NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit ?
    4. What is the difference between NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix/DNA Assembly Cloning kit/Bundle for Large Fragments kit and the current NEB Gibson Assembly Master Mix/Cloning Kit?
    5. What is the largest single fragment that has been assembled with NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix?
    6. How many fragments of DNA can be assembled in one reaction?
    7. Is this method applicable to the assembly of repetitive sequences?
    8. What are the shortest overlaps that can be used with this assembly method?
    9. What are the longest overlaps that can be used with this method?
    10. Can ≤ 200 bp dsDNA fragments be assembled by this method?
    11. Can multiple ssDNA oligonucleotides be assembled with dsDNA fragments?
    12. Can longer or shorter incubation times be used?
    13. Will the reaction work at other temperatures?
    14. Is it necessary to purify PCR products when doing DNA assemblies using either NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix or Gibson Assembly Master Mix?
    15. Is it necessary to inactivate restriction enzymes after vector digestion?
    16. I would like to produce overlapping dsDNA fragments by PCR. Do I need to use PCR primers that have been purified by PAGE or HPLC?
    17. I would like to assemble ssDNA oligonucleotides into dsDNA fragments. Do I need to use oligonucleotides that have been purified by PAGE or HPLC?
    18. Can I use a 15-nt overlap that is entirely composed of His-tag repeats (i.e., CACCACCACCACCAC)?
    19. Can I PCR-amplify the assembled product?
    20. The NEBuilder Positive Control reaction is not resulting in any colonies. Why?
    21. What should I do if my assembly reaction yields no colonies, a small number of colonies, or clones with the incorrect insert size following transformation into E. coli?
    22. How can I reduce the number of vector-only background colonies?
    23. What type of competent cells are suitable for transformation of DNA constructs created using NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix?
    24. Can I use electroporation instead of chemical transformation?
    25. Are there any differences between the requirements for 2–3 fragment assemblies versus 4+?
    26. Can I use PCR product amplified from Taq DNA polymerase?
    27. Can I Use other primer design tools such as SnapGene for Gibson Assembly, to design primers for NEBuilder HiFi DNA Assembly?
    28. Do you have any suggestions on how to improve DNA assembly when using synthesized DNA (e.g. gBlocks) and NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (E2621/E5520/E2623)?
    29. I want to join two fragments, but the overlap sequence is 500bp from the end of the vector. Can NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix accomplish this?
    30. How can I improve the efficiency of very complex assembly reactions when using NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix?
    31. How should fragments be prepared for assembly using NEBuilder HiFi?
    32. I would like to miniaturize DNA assembly with NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix using the Labcyte Echo Liquid Handler. Do you have any information that I can refer to help me automate DNA assembly?
    33. How does overlap length affect NEBuilder HiFi DNA Assembly efficiency?
    34. What antibiotic resistance is encoded in the NEBuilder Positive Control (assembly control)?

  • 实验技巧

    想了解 DNA 组装原理吗？ 观看此短视频了解更多信息。
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    NEBuilder 高保真 DNA 组装可以使用合成的单链 DNA 寡核苷酸桥式连接两个双链 DNA 片段，构建简单又快速。观看此短视频了解更多信息。
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    设计 DNA 组装实验时，建议采用计算机方式设计实验，帮助您设计引物。观看此短视频了解更多信息。

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