Q5® 定点突变试剂盒 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

Q5 定点突变试剂盒可以在 2 小时内快速对双链质粒 DNA 进行定点突变（图 1）。该试剂盒使用稳定的 Q5 热启动超保真 DNA 聚合酶，结合客户自行设计的引物，在各种质粒中引入插入、缺失和替换突变。PCR 后将扩增材料直接添加到独特的激酶-连接酶-DpnI（KLD）酶混合液中，进行快速室温环化和模板去除（5 分钟）（图 2）。转化到高效级 NEB 5-alpha E. coli 感受态细胞（随试剂盒提供），以确保转化长度至少为 20 kb 的质粒能获得稳定的结果。

图 1：2 小时内完成定点突变。Q5® 定点突变试剂盒 |
使用预混液、独特的多酶 KLD 酶混合液和快速聚合酶可确保大多数质粒的突变反应在两小时内完成。

 

图 2：Q5 定点突变试剂盒概览。 Q5® 定点突变试剂盒 |
此试剂盒经优化设计，可快速有效地将插入、缺失和替换引入双链质粒 DNA。第一步是使用常规引物和 Q5 热启动超保真 DNA 聚合酶的预混液进行指数扩增。第二步是使用含有激酶、连接酶和 DpnI 的独特酶混合液一起温育。在这些酶的共同作用下，可实现 PCR 产物快速环化，并去除模板 DNA。最后一步是转化到高效级化学感受态细胞（随试剂盒提供）。
图 3：Q5 定点突变试剂盒引物设计Q5® 定点突变试剂盒 |
使用专门设计的正向（黑色）和反向（红色）引物，将替换、缺失和插入引入质粒 DNA。与依赖线性扩增的试剂盒不同，为 Q5 定点突变试剂盒设计的引物不会重叠，从而可以确保实现
指数扩增的优势。A）通过在正向引物的中间引入所需更换的核苷酸（* 表示）来产生替换，在突变的 3´ 侧应包含至少 10 个互补核苷酸序列。设计的反向引物应让两条引物的 5´ 末端背靠背退火。B）通过对删除区域两侧设计标准的、非突变正向和反向引物，来进行缺失改造。C）将少于或等于 6 个核苷酸的插入引入正向引物的 5´ 末端，同时反向引物与正向引物的互补区域的 5´ 末端背靠背退火。D）可以通过将所需插入序列的一半引入两条引物的 5´ 末端以实现更大片段的插入。插入片段的大小上限很大程度上取决于寡核苷酸合成的限制。
图 4：NEB Q5 SDM 试剂盒比 Agilent QuikChange® SDM 试剂盒的转化效率更高
Q5® 定点突变试剂盒 |
图中显示了使用背靠背对照 SDM 引物混合液和对照 SDM 质粒（6.7 kb）进行的替换反应（4 nt）的结果，以及 12 nt 缺失实验（5.8 kb 质粒）和 18 nt 插入实验（7.0 kb 质粒）的结果。在这三种实验中，得到菌落的预期突变效率在 90% 以上。如果细胞在涂板前未稀释，则将结果标准化为转化子总数。为了进行比较，使用 QuikChange Lightning 定点突变试剂盒（Agilent）按照 Agilent 操作流程进行相同的替换反应（4 nt），并使用 Agilent 引物设计工具设计重叠引物。

*请注意，QuikChange 试剂盒不适用于这种大小的缺失和插入，因此无法对这些实验进行比较。

产品类别:
DNA Assembly, Cloning and Mutagenesis Kits Products

应用:
Site Directed Mutagenesis,
Site Directed Mutagenesis

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E0554S     Multi-temperature    
        Q5® Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix M0494AVIAL -20 1 x 0.125 ml 2 X
        KLD Reaction Buffer B0554AVIAL -20 1 x 0.15 ml 2 X
        KLD Enzyme Mix M0554AVIAL -20 1 x 0.01 ml 10 X
        Control SDM Primer Mix S0554AVIAL -20 1 x 0.01 ml 10 µM
        Control SDM Plasmid N0554AVIAL -20 1 x 0.01 ml 5 µg/ml
        pUC19 Vector N3041AVIAL -20 1 x 0.025 ml 50 pg/µl
        SOC Outgrowth Medium B9020SVIAL 4 1 x 25 ml Not Applicable
        NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) C2987HVIAL -80 10 x 0.05 ml Not Applicable

  • 优势和特性

    Features

    • 在质粒 DNA 中引入突变、插入或缺失
    • 非重叠的引物设计保证高效的指数扩增，并从多种模板中产生高百分比的期望突变
    • 分子内连接及转化到 NEB 高效级感受态细胞可得到较多菌落
    • Q5 热启动超保真 DNA 聚合酶错配率极低，可缩短筛选时间
    • 热启动聚合酶可实现室温建立反应体系
    • DpnI 降低背景，模板起始量浓度范围更广
    • 使用常规引物避免了磷酸化或纯化寡核苷酸的额外费用
    • 易于使用的 PCR 预混液和独特的多酶 KLD 混合液更加方便，质量更高
    • 在室温条件下，五分钟内即可完成快速直接的处理步骤

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  • 注意事项

    1. 贮存说明：
      Q5 定点突变试剂盒在 –80℃ 可保存一年。为方便起见，Q5 热启动超保真 2X 预混液、KLD 酶混合液、KLD 反应缓冲液、对照引物和模板 DNA 一起包装在一个单独的盒子中；各组份可取出并贮存于 –20℃ 两年，不会损失任何活性。可以取出 SOC 并贮存在室温下。NEB 5-alpha E. coli 感受态细胞必须贮存于 –80℃，并避免反复冻融。

  • 参考文献

    1. Kalnins et al., (1983). The EMBO Journal. 2, 593-597.
    2. Dickinson DJ, Ward JD, Reiner DJ, Goldstein B. (2013). Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination.. Nat Methods. Sep 1, PubMedID: 23995389

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Quick Protocol for Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit (E0554)
    2. Protocol for Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit (E0554)
    3. Protocol for Control Reaction (E0554)

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE0554

  • 应用实例

    • Improved methods for site-directed mutagenesis using NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix

工具 & 资源

  • Web 工具

    • NEBaseChanger

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. How do I design primers to use with the Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit?
    2. What should I use for an annealing temperature with the Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit?
    3. Do I need to purify my plasmid before or after the KLD reaction when using the Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit?
    4. What plasmid sizes can be amplified using the Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit?
    5. What is the maximum number of nucleotides that can be inserted with this kit?
    6. What is the maximum distance that can be tolerated between substitutions?
    7. Typically, what percentage of transformants will have the desired mutation incorporated?
    8. What is the KLD Mix?
    9. Can I use my own competent cells?
    10. If I double my PCR size, should I add more PCR mix to the KLD reaction?
    11. Why is the desired mutation missing from the transformants that I screened?
    12. Why do I not see my PCR product after using the Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit?
    13. I use the Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit to introduce single mutations. How can I introduce multiple mutations?

  • 问题解决指南

    • 确保引物设计正确。除引入缺失外，设计的两条引物的 5´ 末端应背靠背对齐，以利于进行指数扩增（见图 3）。为得到最佳结果，推荐使用 NEB 在线引物设计软件 NEBaseChanger™ 设计引物并计算退火温度。
    • 取 2–5 μl 反应体系在琼脂糖凝胶上观察，确保 PCR 产物单一。对于低纯度或不纯的 PCR 产物，请按照以下建议操作。
    • KLD 反应液中仅使用 1 μl PCR 产物。使用过多 PCR 产物可能会降低转化效率。如果 PCR 产量过低，可将更多产物添加到 KLD 反应液中，但必须在转化之前进行纯化，例如 PCR 纯化。
    • 转化时仅使用 5 μl KLD 反应液。如果添加更多 KLD 反应液，则应在转化之前进行纯化，例如 PCR 纯化。
    • 确保质粒中的选择性 DNA Marker 与平板中使用的筛选剂相匹配
    • 确保 NEB 5-alpha E. coli 感受态细胞贮存于 -80℃。
    • 检查感受态细胞的转化效率是否约为 1 x 109 cfu/μg。为了计算转化效率，将 2 μl 对照 pUC19 DNA（100 pg）转化到 50 μl 细胞。按照第 8 页的转化操作流程进行转化。涂板前，将 10 μl 细胞在 SOC 中稀释至 1 ml。取 100 μl 稀释液涂板。在本例中，150 个菌落的转化效率将为 1.5 x 109 cfu/μg
      （μg DNA = 0.0001，稀释度 = 10/1000 x 100/1000）。

    没有 PCR 产物或产物很少

    • 确保使用最佳退火温度（Ta）。高保真聚合酶适合 Tm+3 退火温度。使用 NEB 在线引物设计软件 NEBaseChanger™ 计算 Ta。另外，可以使用梯度 PCR 和琼脂糖凝胶分析来确定最佳退火温度。
    • 确保延伸时间与质粒长度相匹配。建议每 kb 质粒延伸时间为 20–30 秒。
    • 确保每个引物的终浓度为 0.5 μm。
    • 用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化引物。

    得到的质粒不包含所需的突变

    • 确保正确设计突变引物。
    • 优化 PCR 条件（见上文）。
    • 在 PCR 步骤中使用 1–25 ng 模板。如果使用少于 1 ng 或多于 25 ng 的模板，则会小幅增加未引入/不正确突变的克隆数量。

  • 实验技巧

    1. 如果得到的质粒不包含所需的突变（野生型序列），建议在 PCR 步骤中使用 ≤ 10 ng 的模板。另外，也可将 KLD 温育时间延长至 30-60 分钟来减少野生型质粒的背景。

    2. 如果没有菌落或菌落很少，请确保引物设计正确。除引入缺失外，设计的两条引物的 5´ 末端应背靠背对齐，以利于进行指数扩增。为得到最佳结果，推荐使用 NEB 在线引物设计软件 NEBaseChanger™ 设计引物并计算退火温度。

    3. 如果没有 PCR 产物或产物很少，请确保使用了最佳退火温度（Ta）。高保真聚合酶适合 Tm+3 退火温度。使用 NEB 在线引物设计软件 NEBaseChanger™ 计算 Ta。另外，可以使用梯度 PCR 和琼脂糖凝胶分析来确定最佳退火温度。