Monarch® 基因组 DNA 提取试剂盒 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

Monarch 基因组 DNA 提取试剂盒可以提供细胞裂解、RNA 去除，以及提取纯化完整基因组 DNA（gDNA）的综合解决方案，适用于多种生物样本，如培养细胞、血液和哺乳动物组织。只要增加一步来提高裂解效率，也适用于细菌和酵母等难裂解样本。此外，该试剂盒还提供从临床相关样本（例如唾液和颊拭子）中提取 DNA 和快速纯化已经提出的基因组 DNA 的操作说明。 纯化后的基因组 DNA 具有极高质量：A260/A280 比值 > 1.8，A260/A230 比值 > 2.0，DIN 值高且 RNA 残留极低。纯化后的基因组 DNA 适用于终点 PCR、qPCR 和 NGS 文库制备等多种下游应用。该试剂盒的峰值片段大小通常 > 50kb，特别适用于长读长测序平台的应用。

Monarch 基因组 DNA 提取试剂盒实验流程

Monarch® 基因组 DNA 提取试剂盒 |

规格：

样本起始量：

培养的哺乳动物细胞：高达 5 x 106 个细胞

哺乳动物全血：100 µl

组织：高达 25 mg（取决于组织类型）

细菌：高达 2 x 109

酵母：高达 5 x 107

唾液：高达 500 µl

颊粘膜拭子

基因组 DNA 需要纯化

结合能力： 30 µg 基因组 DNA
产量： 取决于样本类型
基因组 DNA 大小： 对于大多数样本类型，峰值片段大小通常 > 50 kb；对于唾液和颊粘膜拭子，该值可能较低
RNA 含量 < 1%（RNase A 处理后）
洗脱体积 ≥ 35 µl，推荐使用 100 µl
纯度： A260/280 比值 ≥ 1.8
A260/230 比值 ≥ 2.0

 

经过验证的样本类型：

  • 小鼠尾巴
  • 小鼠耳朵
  • 小鼠肝
  • 大鼠肝
  • 小鼠肾
  • 小鼠脾
  • 小鼠心脏
  • 小鼠肺
  • 小鼠脑
  • 大鼠脑

  • 小鼠肌肉
  • 大鼠肌肉
  • 鹿肌肉
  • 人血
  • 小鼠血
  • 兔血
  • 猪血
  • 豚鼠血
  • 牛血
  • 马血
  • 狗血
  • 鸡血
  • HeLa 细胞
  • HEK293 细胞
  • NIH3T3 细胞
  • 大肠杆菌
  • 类球红细菌
  • 蜡样芽孢杆菌
  • 极端嗜热古菌
  • 酿酒酵母
  • 唾液
  • 颊粘膜拭子
图 1：Monarch 基因组 DNA 提取试剂盒可从多种样本中高效纯化高质量、高分子量的基因组 DNA。

Monarch® 基因组 DNA 提取试剂盒 |

每个样本各取 100 ng 基因组 DNA，上样到 0.75% 的琼脂糖凝胶。血液、培养的细胞和组织按照标准操作说明进行提取，颊粘膜拭子、唾液、革兰氏阴性菌和阳性菌用补充操作说明进行提取。起始样本：1 x 106 个 Hela 细胞、100 μl 人类血液、10 μl 鸟血、10 mg 冷冻组织粉末、1 个颊粘膜拭子、500 μl 唾液和约 1 x 109 个细菌细胞。使用 Lambda DNA-HindIII 消化（NEB #N3012）作为 DNA Marker 上样于最后一条泳道（M）。在 Agilent Technologies® 4200 TapeStation® 上，使用 Genomic DNA ScreenTape® 分析纯化后的基因组 DNA 样本。样本峰值产量通常在 50–70 Kb 之间，DIN 值约为 9。在准备颊粘膜拭子和唾液的过程中，难免会出现细胞破损，这会导致形成弥散状的低分子量凋亡条带。
图 2：Monarch 基因组 DNA 提取试剂盒可从组织中提取极高产量 DNA，而这一点是其它市售试剂盒无法实现的。

Monarch® 基因组 DNA 提取试剂盒 |

将保存在 RNAlater® 中的 10 mg 大鼠组织重复样本切成小块，然后按照每个试剂盒提供的操作说明进行裂解和纯化。可选的 RNase A 步骤也包含在内。使用各试剂盒中提供的洗脱缓冲液进行洗脱，洗脱体积为 100 µl。所示产量为 2 个重复样本的平均值，该数值为使用 LC-MS 测定 RNA 含量并进行校正后的基因组 DNA 的产量。结果显示，Monarch 基因组 DNA 提取试剂盒可从多种组织中提取高产量 DNA。
图 3：Monarch 基因组 DNA 提取试剂盒提取出的高质量基因组 DNA 适用于长片段 PCR 和 qPCR 等灵敏的下游实验。

Monarch® 基因组 DNA 提取试剂盒 |

A.每个样本以 25 ng 人类 DNA 作为模板，用 LongAmp® 热启动 Taq 2X 预混液（NEB #M0533）和特异引物分别扩增出 6、8、10、12、16、20 kb 扩增产物。PCR 反应在 Applied Biosystems 2720 热循环仪中进行。用 Monarch 试剂盒提取 Hela 细胞 DNA 和人类血液基因组 DNA，与市售的人类细胞系 NA19240 F11 参照 DNA 进行比较。从 20 µl 中取 10 ul 上样到 1.5% 琼脂糖凝胶上，用 1 kb DNA Ladder（NEB #N3232）作为电泳参照。结果显示 DNA 高度完整，非常适合长片段 PCR。

B.使用 Monarch 试剂盒，从人类全血、Hela 细胞和小鼠尾巴提取基因组 DNA，10 倍梯度稀释 5 次作为起始 DNA 模板浓度。在 Bio-Rad® CFX Touch qPCR 热循环仪中，用 Luna 通用 qPCR 预混液和（NEB #M3003）特异引物对 gHEME（人类全血）和 gREL（Hela，小鼠尾巴）进行 qPCR 测定。结果显示 DNA 纯度很高，不含抑制剂，非常适合 qPCR。

图 4：Monarch 基因组 DNA 提取试剂盒可与用于 Illumina® 平台的 NEBNext® 试剂盒结合使用，为 NGS 文库制备提供优质的起始样本。

Monarch® 基因组 DNA 提取试剂盒 |

A.使用 NEBNext Ultra II FS DNA 文库制备试剂盒 – 含片段化酶（NEB #E7805），通过 Monarch（橙色）或 Qiagen DNeasy 小量提取试剂盒（蓝色），提取出 100 ng HeLa 细胞基因组 DNA，以此为样本制备不同的文库。使用 Illumina MiSeq 对文库进行测序。使用 Bowtie 2.2.4 比对 read，并使用 Picard 的 CollectGCBiasMetrics（v1.117）计算 GC 覆盖度。预期的标准覆盖度 1.0 以灰色的水平线表示，不同的 GC% 中 100 bp 区域的数量以灰色条形图显示，彩色折线表示标准化后的文库覆盖度。Monarch GC 覆盖度与 Qiagen DNeasy 结果相符。

B.使用 Monarch 提取的基因组 DNA 时，经酶法片段化后制备的文库产量相同。在 Agilent Technologies® 2100 BioAnalyzer 上使用高灵敏度 DNA 试剂盒评估上述样本的文库产量。

图 5：使用 Monarch gDNA 纯化试剂盒，按照基于 RBC 裂解的操作说明，从大量血液中分离 DNA

Monarch® 基因组 DNA 提取试剂盒 |

与直接提取法相比，RBC 裂解法提取的 DNA 具有相同的高产量和高浓度；此外，还能从体积更大、数量更多的血液中提取 DNA。从存放三天的新鲜猪血中提取基因组 DNA，每种样本进行三次重复。对于直接裂解样本，按照 NEB #T3010 试剂盒中新鲜哺乳动物血液的标准操作说明，从 100 µl 猪血中提取 DNA。对于 RBC 裂解样本，使用 NEB #T3010 试剂盒和 RBC 裂解液（NEB #T3051），以操作说明中指定数量的猪血为起始样本，血样高达 500 µl。
图 6：使用 Monarch 基因组 DNA 提取试剂盒获得的高质量 DNA 可用于 Nanopore 测序。

Monarch® 基因组 DNA 提取试剂盒 |

使用 Monarch 基因组 DNA 提取试剂盒或 Qiagen DNeasy 血液和组织试剂盒提取 HeLa 细胞基因组 DNA。按照 ONT 1D 连接测序试剂盒（SQK-LSK109）的操作说明，无 DNA 片段化，使用 1 mg 纯化 DNA 制备 Oxford Nanopore Technology（ONT）测序文库。将文库上样到 GridION（Flow cell R9.4.1）上并收集 48 小时数据。就常见测序指标而言，使用 Monarch gDNA 制备的文库超过了 Qiagen 文库。这些指标包括：A. 收集的测序总数据，B. read 质量，以及 C. read 长度。通过 NanoComp 生成数据（Bioinformatics, Volume 34, Issue 15, 1 August 2018, Pages 2666–2669）。
产品类别:
Genomic DNA Extraction & Purification Products,
Nucleic Acid Purification Products

应用:
Nucleic Acid Purification

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • T3010S     25    
        Monarch® gDNA Tissue Lysis Buffer T3011-1 25 1 x 12 ml Not Applicable
        Monarch® gDNA Cell Lysis Buffer T3012-1 25 1 x 6 ml Not Applicable
        Monarch® gDNA Blood Lysis Buffer T3013-1 25 1 x 6 ml Not Applicable
        Monarch® gDNA Binding Buffer T3014-1 25 1 x 24 ml Not Applicable
        Monarch® gDNA Wash Buffer T3015-1 25 1 x 18 ml Not Applicable
        Monarch® gDNA Elution Buffer T3016-1 25 1 x 14 ml Not Applicable
        Monarch® gDNA Purification Columns T3017-1 25 1 x 50 columns Not Applicable
        Monarch® Collection Tubes II T2018-1 25 2 x 50 tubes Not Applicable
        Proteinase K, Molecular Biology Grade P8200AAVIAL -20 1 x 0.55 ml 20 mg/ml
        Monarch® RNase A T3018-1 -20 1 x 0.17 ml 20 mg/ml
    • T3010L     25    
        Monarch® gDNA Tissue Lysis Buffer T3011-2 25 1 x 34 ml Not Applicable
        Monarch® gDNA Cell Lysis Buffer T3012-2 25 1 x 20 ml Not Applicable
        Monarch® gDNA Blood Lysis Buffer T3013-2 25 1 x 20 ml Not Applicable
        Monarch® gDNA Binding Buffer T3014-2 25 1 x 65 ml Not Applicable
        Monarch® gDNA Wash Buffer T3015-2 25 1 x 60 ml Not Applicable
        Monarch® gDNA Elution Buffer T3016-2 25 1 x 34 ml Not Applicable
        Monarch® gDNA Purification Columns T3017-1 25 3 x 50 columns Not Applicable
        Monarch® Collection Tubes II T2018-1 25 6 x 50 tubes Not Applicable
        Proteinase K, Molecular Biology Grade P8200AAVIAL -20 3 x 0.55 ml 20 mg/ml
        Monarch® RNase A T3018-2 -20 1 x 0.5 ml 20 mg/ml

  • 注意事项

    1. 使用试剂盒后，Monarch RNase A 和蛋白酶 K 需要贮存在 -20℃ 条件下。

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Quick Protocol for Extraction and Purification of Genomic DNA
    2. Download Quick Protocol Card T3010
    3. Protocol for Extraction and Purification of Genomic DNA from Cells (NEB #T3010)
    4. Protocol for Extraction and Purification of Genomic DNA from Tissues (NEB #T3010)
    5. Protocol for Extraction and Purification of Genomic DNA from Blood (NEB #T3010)
    6. Genomic DNA Purification from Gram-negative Bacteria (NEB #T3010)
    7. Genomic DNA Purification from Gram-positive Bacteria and Archaea (NEB #T3010)
    8. Genomic DNA Purification from Yeast (NEB #T3010)
    9. Genomic DNA Purification from Buccal Swabs (NEB #T3010)
    10. Genomic DNA Purification from Saliva (NEB #T3010)
    11. Protocol for Genomic DNA Cleanup (NEB #T3010)
    12. Genomic DNA Purification from Insects
    13. Protocol for Isolation of Genomic DNA (gDNA) from up to 500 µl mammalian blood using the Monarch® Genomic DNA Purification Kit (NEB #T3010) and RBC Lysis Buffer (NEB #T3051)
    14. Protocol for Genomic DNA Extraction from Cultured Cells Stabilized with Monarch® DNA/RNA Protection Reagent (NEB #2011) using the Monarch Genomic DNA Purification Kit (NEB #T3010)
    15. Protocol for Genomic DNA Extraction from Blood Stabilized with Monarch® DNA/RNA Protection Reagent (NEB #T2011) using the Monarch Genomic DNA Purification Kit (NEB #T3010)
    16. Protocol for Genomic DNA Extraction from Tissue Samples Stabilized with Monarch® DNA/RNA Protection Reagent (NEB #T2011) using the Monarch Genomic DNA Purification Kit (NEB #T3010)
    17. Protocol for Genomic DNA Extraction from Gram-negative Bacteria using NEBExpress® T4 Lysozyme (NEB #P8115) and the Monarch® Genomic DNA Purification Kit (NEB #T3010)
    18. Protocol for Genomic DNA Extraction from Gram-positive Bacteria using NEBExpress® T4 Lysozyme (NEB #P8115) and the Monarch® Genomic DNA Purification Kit (NEB #T3010)

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualT3010

  • 使用指南

    • Choosing Input Amounts for the Monarch Genomic DNA Purification Kit
    • Factors Affecting DNA Quality when Purifying gDNA from Blood and Tissues with the Monarch Genomic DNA Purification Kit
    • Guidelines for Handling Tissue Samples when using the Monarch Genomic DNA Purification Kit

  • 应用实例

    • A Practical Guide to Analyzing Nucleic Acid Concentration and Purity with Microvolume Spectrophotometers

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. What is the composition of each buffer provided with the Monarch® Genomic DNA Purification Kit?
    2. What is the maximum binding capacity of the Monarch® Genomic DNA Purification Kit columns?
    3. What is the minimum elution volume that can be used with the Monarch® Genomic DNA Purification Kit columns?
    4. How important is it to pre-heat the elution buffer to 60°C? Would 56°C be OK?
    5. Can I get better recovery with the Monarch® Genomic DNA Purification Kit if I do a second elution with my eluent from the first elution?
    6. Can I use a different elution buffer than the one supplied with the Monarch Genomic DNA Purification Kit (NEB #T3010)?
    7. What size gDNA can be purified with the Monarch® Genomic DNA Purification Kit?
       
    8. What is the minimal input amount that can be used with the Monarch® Genomic DNA Purification Kit?
    9. Can I use the Monarch® Genomic DNA Purification Kit to clean up gDNA that was extracted with phenol/chloroform?
    10. Can I use the Monarch® Genomic DNA Purification Kit for gDNA cleanup?
       
    11. How can I assess gDNA integrity and purity?
    12. Can I use a different RNase A with the Monarch® Genomic DNA Purification Kit?
    13. Can I use a different Proteinase K with the Monarch® Genomic DNA Purification Kit?
    14. Can I omit the low-speed binding centrifugation step to save time?
    15. Can I omit the RNase digestion step from the protocol? 
    16. How should I store purified gDNA samples?
    17. Is Monarch-purified gDNA suitable for long-range PCR?
    18. Can I purchase Monarch buffers and columns separately?
    19. When working with other commercial silica column-based kits, I occasionally see a white precipitate in the eluate. What is this?
    20. Can I use Monarch® RNase A for applications/workflows other than gDNA purification?
    21. Is Monarch-purified gDNA compatible with Next Generation Sequencing (NGS) platforms like PacBio and nanopore?
    22. Why did the silica membrane on my Monarch Genomic DNA Column (NEB #T3017) dislodge during my genomic DNA prep?
    23. Can the Monarch Genomic DNA Purification Kit (NEB #T3010) be used to isolate gDNA from drosophila and other insects?
    24. Can the Monarch Genomic DNA Purification Kit (NEB #T3010) be used to isolate gDNA from plants?
    25. Can the Monarch Genomic DNA Purification Kit (NEB #T3010) be used to isolate gDNA from plasma, serum and urine?
    26. Can the Monarch Genomic DNA Purification Kit (NEB #T3010) be used for isolating cfDNA?
    27. Can the Monarch Genomic DNA Purification Kit (NEB #T3010) be used with a vacuum manifold?
    28. The enzymes in the kit were not stored at -20°C right away. Will they still work?
    29. Does it matter which anticoagulant is used in blood samples?
    30. There is a precipitate in the Proteinase K enzyme tube, is this normal?

  • 问题解决指南

    • Troubleshooting Guide for Genomic DNA Extraction & Purification (NEB #T3010)