Next® 多样本接头引物试剂盒 1（96 种 Unique 双端 Index 引物） |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

NEBNext® 接头采用了一种新型的发卡环状结构，能以更高的效率连接末端经修复和加 dA 尾的 DNA 片段。环状结构 DNA 中包含一个 U，当 U 被 USER® 酶（UDG 和 Endo VIII 的混合物）切掉后，环状结构打开，使它可以成为 PCR 反应的底物。通过 NEBNext Index 引物在 PCR 步骤中引入 Barcode，从而有助于实现多重测序文库制备。此试剂盒包含 96 对预混合的独特的 i5 和 i7 Index 引物，封装在可穿透铝箔密封的一次性 96 孔板中。

NEBNext 接头引物可与 NEBNext 产品以及其它兼容 Illumina 平台的标准文库制备流程结合使用。

还提供双端 Barcode 引物（NEB #E7600、NEB #E7780），以及 12 种和 96 种单端 Index 引物（NEB #E7335、NEB #E7500、NEB #E7710、NEB #E7730、NEB #E6609）。也提供甲基化的 NEBNext 接头（NEB #E7535），可用于重亚硫酸盐测序流程。

流程：

NEBNext 接头专为 DNA、ChIP DNA 和 RNA（但不包括 Small RNA）文库制备而设计，能够实现高效的接头连接和高文库产量，并最大限度减少接头二聚体的形成。NEBNext 接头采用了一种新型的发卡环状结构，能以更高的效率连接末端经修复和加 dA 尾的 DNA 片段。环状结构 DNA 中包含一个 U，当 U 被 USER 酶（UDG 和核酸内切酶 Endo VIII 的混合物）切掉后，环状结构打开，使它可以成为 PCR 反应的底物。通过 NEBNext Index 引物在 PCR 步骤中引入 Barcode，从而有助于实现多重测序文库制备。此试剂盒包含 96 种预混合的 8 bp Index 引物，封装在可穿透铝箔密封的一次性 96 孔板中。

如需使用 384 种 Index 引物进行多重测序，请将此试剂盒与 NEB #E6442、NEB #E6444 和 NEB #E6446 结合使用。
 

图 1：演示使用 NEBNext 多样本接头引物试剂盒 1（96 种 Unique 双端 Index 引物）的实验流程

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图 2：使用 NEBNext 接头和 Unique 双端 Index 引物可显著提高文库产量并最大限度减少接头二聚体

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以 100 ng 人源 NA19240 基因组 DNA（Coriell 研究所）为样本，用 NEBNext Ultra II FS DNA 文库制备试剂盒构建 16 个文库。接头和引物来自 IDT® for Illumina® –TruSeq® DNA UD Index（Illumina #20022370），或 NEBNext 多样本接头引物试剂盒 1（96 种 Unique 双端 Index 引物）。4 个 PCR 循环后，用 Agilent® TapeStation® 4000 定量文库。A）使用 NEBNext 接头和 Unique 双端 Index 引物，以及其对应的实验流程制备的 8 个文库，平均文库产量提高了 60%。B）根据 16 个文库的 TapeStation 检测结果，使用 IDT for Illumina 接头和引物制备文库产生了接头二聚体（橙色箭头所示），而用 NEBNext 接头和引物制备文库未产生接头二聚体，且文库的产量也更高。

 

图 3：使用 NEBNext 96 种 Unique 双端 Index 引物扩增的文库在 Illumina® NovaSeq™ 6000 上发生均匀的簇生成

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使用 NEBNext Ultra II FS DNA 文库制备试剂盒（图 1）和 NEBNext 96 种 Unique 双端 Index 引物制备的 96 个文库以等摩尔浓度混合并用 Illumina NovaSeq 6000 仪器（2 x 150 bp）测序。汇总了所有文库的 Read 总数，并确定每个文库 Read 总数所占的比例（每个文库的预期比例 = 1.04%）。全部 96 个文库都发生有效的簇生成，并且都呈现近似预期的频率。

 

图 4：NEBNext 96 种 Unique 双端 Index 引物以同等效率扩增文库

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以人源 NA19240 基因组 DNA（Coriell 研究所）为样本，使用 NEBNext Ultra II FS DNA 文库制备试剂盒、Covaris 超声打断的 DNA 结合 NEBNext Ultra II DNA 文库制备试剂盒、Ultra II DNA 文库制备试剂盒结合重亚硫酸盐转化 DNA，或 NEBNext Ultra II RNA 链特异性文库制备试剂盒，制备 96 个文库。使用 NEBNext 96 种 Unique 双端 Index 引物对文库进行 PCR 扩增，生成包含独特 i5 和 i7 Index 的文库。使用 Agilent® TapeStation® 4200 对文库产量进行定量，并通过汇总全部 96 个文库的总产量和计算每个文库的占比进行标准化（每个文库的预期比例 = 1.04%）。每种文库制备方法的文库扩增效率都很稳健，而且全部 96 种 Unique Index 引物组合的效率都很一致。每根柱条代表至少 2 组平行重复实验的平均值。

 

图 5：Unique 双端 Index 引物可以识别和去除 Index-hopped 的 read。

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一组 96 个 NEBNext Ultra II FS DNA 文库（图 2），用于评估 read 分类的准确性以及过滤使用 Unique 双端 Index 发生 Barcode-hopped 的 read。将 96 个文库以等摩尔浓度混合，并用 NovaSeq 6000（2 x 150 bp）和 MiSeq®仪器（2 x 76 bp）测序。考虑到 Index，使用 Picard ExtractIlluminaBarcodes 工具对 read 进行拆分，并将其分为以下类别：

  • 拆分的 read：预期的 i5 和 i7 Barcode 组合
  • 识别的 index hopping：符合预期的 barcode，但不是预期的组合
  • 深色簇：N 或 G read（由于四色测序，不能在 MiSeq 上观察到）
  • Phi X：任何与通用引物序列匹配的 read（MiSeq 实验中不存在）
  • 其它：任何不属于上述类别的剩余 read

使用单端 i5 或 i7 Index（或 i5 和 i7 的非唯一组合）进行拆分，将错误分配 NovaSeq 上约 5% 的 read 和 MiSeq 上 0.6% 的 read，导致错误分配样本之间的 read 并影响下游分析。Unique 双端 Index 不仅能够成功识别 read，还能在拆分过程中拒绝来源不明的 read。

图 6：利用 NEBNext 多样本接头引物试剂盒 1-4（96 种 Unique 双端 Index 引物）的 384 对引物扩增的文库在 Illumina NovaSeq™ 6000 上发生均匀的簇生成

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使用 NEBNext Ultra II DNA 文库制备试剂盒（NEB #E7645）和 NEBNext 多样本接头引物试剂盒 1-4（96 种 Unique 双端 Index 引物）制备的 384 个文库，以等摩尔浓度混合并用 Illumina NovaSeq® 6000 仪器测序。汇总了所有文库的 Read 总数，并确定每个文库 Read 总数所占的比例（每个文库的预期比例 = 0.26%）。全部 384 个文库都发生有效的簇生成，并且都呈现近似预期的频率。
产品类别:
NEBNext® Multiplex Oligos (Adaptors & Primers) Products,
Next Generation Sequencing Library Preparation Products

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E6440S     -20    
        USER® Enzyme E6610AVIAL -20 1 x 0.288 ml Not Applicable
        NEBNext® 96 Unique Dual Index Primer Pairs Plate (L) E6441AVIAL -20 1 x 10 μl/well 10 µM
        NEBNext® Adaptor for Illumina® E6612AVIAL -20 1 x 0.96 ml 15 µM
    • E6440L     -20    
        USER® Enzyme E6610AAVIAL -20 2 x 0.576 ml Not Applicable
        NEBNext® 96 Unique Dual Index Primer Pairs Plate (L) E6441AVIAL -20 4 x 10 μl/well 10 µM
        NEBNext® Adaptor for Illumina® E6612AVIAL -20 4 x 0.96 ml 15 µM

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操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Where can I find protocols for using NEBNext® Multiplex Oligos for Illumina® (96 Unique Dual Index Primer Pairs)? (NEB #E6440, #E6442, #E6444, #E6446, #E6448)

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE6440

  • 使用指南

    • E6440_UDI_IlluminaLRM
    • Forward Strand Workflow Sample Sheet for E6440: NovaSeq 6000 with v1.0 reagent kits, MiniSeq with Rapid reagent kits, MiSeq, HiSeq 2000/2500 (paired-end flow cell), HiSeq 3000/4000 (single-read flow cell)
    • Reverse Complement Workflow Sample Sheet for E6440: iSeq 100, MiniSeq with Standard reagent kits, NextSeq Systems, NovaSeq 6000 with v1.5 reagent kits, HiSeq 2000/2500 (single-read flow cell), HiSeq 3000/4000 (paired-end flow cell)

工具 & 资源

  • 选择指南

    • NEBNext® Multiplex Oligos Selection Chart

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Are NEBNext adaptors and primers for Illumina validated in Next Generation Sequencing Workflows?
    2. What is the concentration of the adaptor and primers in the NEBNext Multiplex Oligos kits?
    3. Can I use the 96-well primer plate to do my PCR reactions?
    4. How many reactions worth of primer are in each well?
    5. Is the NEBNext adaptor methylated?
    6. Can I perform single read runs and still get both index sequences? Can I run both single read and paired-end recipes with dual-indexed libraries?
    7. Are dual indexed libraries compatible with single end sequencing?
    8. How many indices are available with NEBNext® Multiplex Oligos for Illumina® (96 Unique Dual Index Primer Pairs) (NEB #E6440, E6442, E6444, E6446, and E6448)?
    9. Can the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs) (NEB #E6440, #E6442, #E6444, #E6446, and #E6448) be used to address “index hopping” with Illumina patterned flow cells?
    10. Where can I find the sample sheets for these Multiplex Oligos?
    11. Which sets of NEBNext Unique Dual Index Primer Pairs can be combined in a single Illumina sequencing run?
    12. How do I use the NEB provided Sample Sheet for my specific instrument?
    13. What sequences need to be trimmed for NEBNext libraries that are sequenced on an Illumina instrument?