Next® 多样本接头引物试剂盒 1（Unique 双端 Index 引物，UMI 接头，适用于 RNA） |NEB酶试剂 New England Biolabs

发表于由

上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

NEBNext 多样本接头引物试剂盒 1（Unique 双端 Index 引物，UMI 接头，适用于 RNA）经过精心设计，能够实现更精简和信息更丰富的 NGS 多重检测、更准确的转录本丰度测定，同时去除 PCR 重复。这些 Index 接头含有一对 Unique 双端 Index 引物（i5 和 i7）以及一个 11 nt UMI 序列。试剂盒提供 96 个独特的、预混的含有 UMI 的接头引物，包装在一个一次性的密封着可穿刺的铝箔封板膜 96 孔板中。通用引物混合液以独立小瓶提供。

如果按照 UMI 接头特定文库制备试剂盒手册（如下所示）中的操作说明进行操作，则可简单便捷地将 UMI 接头与一种 NEBNext RNA 文库制备试剂盒结合起来使用。

  • NEBNext Ultra II RNA 链特异性文库制备试剂盒（NEB #E7760 或 NEB #E7765）
  • NEBNext Ultra II RNA 非链特异性文库制备试剂盒（NEB #E7770 或 NEB #E7775）
  • NEBNext rRNA 去除试剂盒 v2 – 人/小鼠/大鼠（NEB #E7400 或 NEB #E7405）
  • NEBNext rRNA 去除试剂盒 – 细菌（NEB #E7850 或NEB #E7860）
  • NEBNext Globin RNA & rRNA 去除试剂盒 – 人/小鼠/大鼠（NEB #E7750 或 NEB #E7755）

NEBNext 系列多样本接头引物试剂盒可用于 NEBNext 样品制备或其它兼容 Illumina 平台的标准文库制备流程。除该试剂盒外，还提供含有 UMI 的 Index 引物接头，便于进行 PCR-free 和标准的 DNA 测序流程（NEB #E7395）。对于无需 UMI 的多重检测，NEBNext 提供了多款产品来提高灵活性，包括 Unique 双端 Index 引物（NEB #6440、NEB #6442、NEB #E6444、NEB #E6446）、双端 Index 引物（NEB #E7600 和 NEB #E7780）和单端 Index 引物（12 种和 96 种单端 Index 引物；NEB #E7335、NEB #E7500、NEB #E7710、NEB #E7730、NEB #E6609），以及适用于 EM-seq™ 和重亚硫酸盐测序的 Index 引物（NEB #E7140）。
 

下方显示的 NEBNext 多样本接头引物试剂盒 1（Unique 双端 Index 引物，UMI 接头，适用于 RNA）实验流程详细介绍了文库制备流程的文库检索步骤。

图 1：NEBNext 多样本接头引物试剂盒 1（Unique 双端 Index 引物，UMI 接头，适用于 RNA）实验流程

Next® 多样本接头引物试剂盒 1（Unique 双端 Index 引物，UMI 接头，适用于 RNA） |

图 2：NEBNext Unique 双端 Index 引物 UMI 接头具有同样有效的连接和随后扩增

Next® 多样本接头引物试剂盒 1（Unique 双端 Index 引物，UMI 接头，适用于 RNA） |

A. 以通用人参考（UHR）RNA（Agilent® #740000）为起始样本，使用 NEBNext Poly(A) mRNA 磁性分离模块（NEB #E7490）富集后，再用 NEBNext Ultra II RNA 链特异性文库制备试剂盒（NEB #E7760）制备 96 个文库。使用 Agilent Tapestation 4200 评估建库产量，通过将单个文库产量除以 96 个文库的平均产量对文库进行标准化。全部 96 个 Unique 双端 Index 引物 UMI 接头的一致性和连接效率都很高。每根柱条代表至少 2 组平行重复实验的平均值。

B. NEBNext Unique 双端 Index 引物 UMI 接头具有均一的簇生成效率。96 个文库使用 Illumina NextSeq® 500（PE70）测序。每个文库预计占测序 read 总数的 1.04%。通过将实际的 read 数除以预期的 read 数对文库产量进行标准化。96 个 Unique 双端 Index 引物 UMI 接头文库均未出现偏嗜。

图 3：相较于其它 UMI 接头竞品，NEBNext Unique 双端 Index 引物 UMI 接头的性能更为优越

Next® 多样本接头引物试剂盒 1（Unique 双端 Index 引物，UMI 接头，适用于 RNA） |

以 UHR RNA 为起始样本， 使用 NEBNext Poly(A) mRNA 磁性分离模块（NEB #E7490）富集后，再使用 NEBNext Ultra II RNA 链特异性文库制备试剂盒（NEB #E7760）制备文库。

A. 以 3 种不同起始量（10 ng、100 ng 和 1,000 ng）的总 RNA 为起始样本，图中显示了三个文库的平均产量。使用 NEBNext Unique 双端 Index 引物 UMI 接头或 IDT xGen 双端 Index 引物接头进行接头连接。使用 Agilent Tapestation 4200 评估最终建库产量。

B. 在 Illumina NextSeq 500（PE70）上进行文库测序。向下抽样（seqtk）500 万个 read，并使用 HISAT 2.1 与 GRCh38 参考基因组进行比对。使用 fgbio（AnnotateBamWithUmis）添加 UMI 信息，并使用 MarkDuplicates（Picard 2.18.2.1）标记含有 UMI 的 read 和检测重复率。NEBNext® Unique 双端 Index 引物 UMI 接头制备的文库产生的 read 重复更少。

图 4：结合 UMI 进行分析可提升重复率定量分析的准确度

Next® 多样本接头引物试剂盒 1（Unique 双端 Index 引物，UMI 接头，适用于 RNA） |

以 3 种不同起始量的 UHR RNA（10 ng、100 ng 和 1,000 ng）为起始样本，使用 NEBNext Poly(A) mRNA 磁性分离模块（NEB #E7490）富集后，再使用 NEBNext Ultra II RNA 链特异性文库制备试剂盒（NEB #E7760）制备三个文库，然后在 NextSeq 500 上进行文库测序。向下抽样（seqtk）500 万个 read，并将 read 与 GRCh38 参考基因组（HISAT 2.1）进行比对，并使用 Fgbio（AnnotateBamWithUmis）添加 UMI 信息。提供两种计算重复的方式：位点和 UMI 信息（绿色条），或者仅是通过 MarkDuplicates（Picard 2.18.2.1）得到的位点（黄色条）。

图 5：Unique 双端 Index 引物 UMI 接头可校正 PCR 扩增引起的偏差

Next® 多样本接头引物试剂盒 1（Unique 双端 Index 引物，UMI 接头，适用于 RNA） |

以 UHR RNA 为起始样本， 使用 NEBNext Poly(A) mRNA 磁性分离模块（NEB #E7490）富集后，再使用 NEBNext Ultra II RNA 链特异性文库制备试剂盒（NEB #E7760）制备文库。以 3 种不同起始量的 RNA（10 ng、100 ng 和 1,000 ng）为起始样本，制备四个技术重复的文库。在 NextSeq 500（PE70）上进行文库测序，并向下抽样（seqtk）1,000 万个 read 来进一步分析。为评估 PCR 偏差，使用常规的转录本丰度分析（Salmon 0.9.1）将相同的测序 read 与去重的 UMI read 进行比对。首先与 GRCh38 参考基因组（HISAT 2.1）进行比对，然后使用 Fgbio 添加 UMI 信息，以此完成 UMI 去重复。将非重复 read 随机排序并转化为 fastq，然后使用 Salmon（0.9.1）重新评估转录本丰度。计算 UMI 调整后计数与未去重的原始 read 计数的比例。绘制所有文库中计数大于等于 1 且 UMI 与原始计数比例 ≥2 的转录本数量。总共检测到大约 9 万个转录本。文库制备中增加的 PCR 循环次数与 UMI 校正后迁移的转录本数量相关。

图 6：利用 MDM4（chr1:204,548.089-204,558,681）中的 UMI，调整比对到的 read 的 IGV 可视化图

Next® 多样本接头引物试剂盒 1（Unique 双端 Index 引物，UMI 接头，适用于 RNA） |

在 NextSeq 500（PE70）上测序的 10 ng 文库中，MDM4 位点的多个亚型显示，UMI 与原始计数的比例增长超 2 倍。独特分子的 read 以蓝色显示。可去除 UMI 序列确定的重复 read 以及比对到的 read 位置（红色条），从而提高下游分析中转录本丰度的准确性。

 

产品类别:
NEBNext® Multiplex Oligos (Adaptors & Primers) Products,
Next Generation Sequencing Library Preparation Products

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E7416S     -20    
        NEBNext® UMI RNA Adaptor Plate E7417AVIAL -20 1 x 5 μl/well Not Applicable
        NEBNext® Primer Mix E7397AVIAL -20 1 x 0.48 ml Not Applicable
        NEBNext® UMI Adaptor Dilution Buffer E7398AVIAL -20 2 x 2.5 ml Not Applicable
    • E7416L     -20    
        NEBNext® UMI RNA Adaptor Plate E7417AVIAL -20 4 x 5 μl/well Not Applicable
        NEBNext® Primer Mix E7397AAVIAL -20 2 x 0.96 ml Not Applicable
        NEBNext® UMI Adaptor Dilution Buffer E7398AAVIAL -20 1 x 20 ml Not Applicable

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Where can I find protocols for using NEBNext® RNA Library Prep reagents?

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE7416
    • manualE7750_E7755 w UMI RNA Adaptors E7416
    • manualE7400_E7405 w UMI RNA Adaptors E7416
    • manualE7760_E7765 w UMI RNA Adaptors E7416
    • manualE7850_E7860 w UMI RNA Adaptors E7416
    • manualE7770_E7775 w UMI RNA Adaptors E7416

  • 使用指南

    • E7416_UMI_IlluminaLRM
    • Forward Strand Workflow Sample Sheet for E7416 UMI: NovaSeq 6000 with v1.0 reagent kits, MiniSeq with Rapid reagent kits, MiSeq, HiSeq 2000/2500 (paired-end flow cell), HiSeq 3000/4000 (single-read flow cell)
    • Forward Strand Workflow Sample Sheet for E7416: NovaSeq 6000 with v1.0 reagent kits, MiniSeq with Rapid reagent kits, MiSeq, HiSeq 2000/2500 (paired-end flow cell), HiSeq 3000/4000 (single-read flow cell)
    • Reverse Complement Workflow Sample Sheet for E7416 UMI: iSeq 100, MiniSeq with Standard reagent kits, NextSeq Systems, NovaSeq 6000 with v1.5 reagent kits, HiSeq 2000/2500 (single-read flow cell), HiSeq 3000/4000 (paired-end flow cell)
    • Reverse Complement Workflow Sample Sheet for E7416: iSeq 100, MiniSeq with Standard reagent kits, NextSeq Systems, NovaSeq 6000 with v1.5 reagent kits, HiSeq 2000/2500 (single-read flow cell), HiSeq 3000/4000 (paired-end flow cell)

工具 & 资源

  • 选择指南

    • NEBNext® Multiplex Oligos Selection Chart

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. What are the advantages of UMI adaptors? 
    2. What library prep kits are the NEBNext® Unique Dual Index UMI Adaptors for RNA compatible with? 
    3. How can I reduce adaptor dimer? 
    4. Do you have Sample Sheets for use with the NEBNext® Multiplex Oligos for Illumina® (96 Unique Dual Index UMI Adaptors RNA Set 1)?
    5. Are NEBNext® Unique Dual Index UMI Adaptors for RNA validated in Next Generation Sequencing Workflows? 
    6. Are the NEBNext® Unique Dual Index UMI Adaptors for RNA compatible with single-read and paired-end sequencing?
    7. What are the concentrations of the adaptor and primers in the kit?
    8. How many reactions worth of adaptor is in each well?
    9. Is the NEBNext adaptor methylated?
    10. How many indices are available with NEBNext® Multiplex Oligos for Illumina® (96 Unique Dual Index UMI Adaptors RNA Set 1) NEB #7416?
    11. Is the NEBNext® Unique Dual Index UMI Adaptor for RNA compatible with other manufacturer’s library preparation kits? 
    12. Are dual indexed libraries compatible with single end sequencing?
    13. What sequences need to be trimmed for NEBNext libraries that are sequenced on an Illumina instrument?