Next® 酶学转化法 5hmC 甲基化建库试剂盒 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

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通常，使用基于 NEBNext EM-seq 酶学转化或重亚硫酸盐转化生成的 Illumina 文库，可以检测修饰的 5-甲基胞嘧啶（5mC）和 5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）。但是，这些方法并不能区分 5mC 和 5hmC。

与 EM-seq 相同，NEBNext 酶学转化法 5hmC 甲基化建库试剂盒（E5hmC-seq）使用酶学转化法特异性检测 5hmC 位点，不会像重亚硫酸盐转化法对 DNA 造成损伤，即使 DNA 起始量低至 0.1 ng，也能灵敏地检测 5hmC 位点。

在两步酶法转化过程中，T4-BGT 对 5hmC 进行糖基化，使得 5hmC 在下一步 APOBEC 脱氨基反应中被保护了起来。T4-BGT 不保护 5mC 和未甲基化的胞嘧啶，它们被 APOBEC 脱氨基为尿嘧啶。随后使用 NEBNext Q5U®预混液（Q5® 高保真 DNA 聚合酶的改良版）进行扩增，并在 Illumina 平台上进行测序。

用于 EM-seq 和重亚硫酸盐测序的生物信息学分析工具也可用于 E5hmC-seq。可以从 EM-seq 数据中减去 E5hmC-seq 数据，从而确定单个 5mC 和 5hmC 位点的精确位置。

请注意试剂盒不包含引物，请单独购买（NEBNext 表观遗传建库多样本引物试剂盒，NEB #E3392、NEB #E3404）。

图 1：E5hmC-seq 转化原理

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图 2：使用不同起始量进行建库，E5hmC 均能获得高产量的文库

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使用 Covaris® ME220 仪器将 0.1 ng 至 200 ng 人脑基因组 DNA 打断至 350 bp，并用作 E5hmC-seq 的起始样本，所使用的 PCR 循环数如图所示。使用 Agilent® TapeStation®，High Sensitivity D1000 试剂测定文库产量。显示的数值是四次技术性重复的平均值，误差线表示标准差。结果表明：不同起始量的样本均能获得高产量的 E5hmC-seq 文库。

图 3：E5hmC-seq 文库 5hmC 检出率高

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使用 0.1 ng 至 200 ng 人脑基因组 DNA 制备 E5hmC-seq 文库时，插入所有胞嘧啶完全羟甲基化的 T4 DNA 作为标准品。使用 Covaris® ME220 仪器将 DNA 打断至 350 bp，并用作 E5hmC-seq 的起始样本，构建的文库在 Illumina® NovaSeq 6000（2 x 150 bases）上进行测序。使用 bwa-meth 将每个文库的 19 亿数据（200 ng、10 ng 和 1 ng）或 7.15 亿 数据（0.5 ng 和 0.1 ng）与人类 T2T、lambda 和 T4 参考基因组的复合基因组进行比对。使用 MmethylDackel 从比对结果中提取甲基化信息。显示的数值是两次技术性重复的平均值，误差线表示标准差。结果表明：T4 DNA 标准品 CpG、CHG 和 CHH 中的 5hmC 检出率 ≥ 98.9%。

图 4：使用不同起始量人脑 gDNA 进行建库，E5hmC 表现出一致的总 5hmC 检测结果

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使用 Covaris® ME220 仪器将 0.1 ng 至 200 ng 人脑基因组 DNA 打断至 350 bp，并用作 E5hmC-seq 的起始样本，构建的文库在 Illumina NovaSeq 6000（2 x 150 bases）上进行测序。使用 bwa-meth 将每个文库的 19 亿数据（200 ng、10 ng 和 1 ng）或 7.15 亿 数据（0.5 ng 和 0.1 ng）与人类 T2T、lambda 和 T4 参考基因组的复合基因组进行比对，并使用 MmethylDackel 从中提取甲基化信息。显示的数值是两次技术性重复的平均值，误差线表示标准差。结果表明：不同起始量的样本在 CpG、CHH 和 CHG 中的 5hmC 占比相似。

图 5：E5hmC-seq 文库 GC 覆盖度均一

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使用 Covaris ME220 仪器将 0.1 ng 至 200 ng 人脑基因组 DNA 打断至 350 bp，并用作 E5hmC-seq 的起始样本，构建的文库在 Illumina NovaSeq 6000（2 x 150 bases）上进行测序。使用 bwa-meth 将每个文库的 19 亿数据（200 ng、10 ng 和 1 ng）或 7.15 亿 数据（0.5 ng 和 0.1 ng）与人类 T2T、lambda 和 T4 参考基因组的复合基因组进行比对。使用 Picard 计算 GC 覆盖度，图中显示不同 GC 含量时（0 – 100%），标准化后覆盖度的分布情况。将人类 T2T 基因组的 GC 含量分布绘制为直方图。结果表明：不同起始量的样本所制备的 E5hmC-seq 文库皆能获得均一的 GC 覆盖度。

图 6：使用不同起始量进行建库，E5hmC-seq 均能获得高 GC 覆盖度

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使用 Covaris ME220 仪器将 0.1 ng 至 200 ng 人脑基因组 DNA 打断至 350 bp，并用作 E5hmC-seq 的起始样本。构建的文库在 Illumina NovaSeq 6000（2 x 150 bases）上进行测序。使用 bwa-meth 将每个文库的 19 亿数据（200 ng、10 ng 和 1 ng）或 7.15 亿 数据（0.5 ng 和 0.1 ng）与人类 T2T、lambda 和 T4 参考基因组的复合基因组进行比对。使用 MmethylDackel 从比对结果中提取甲基化信息，以 methylkit 形式提供报告。使用 CpG 结果，针对所有起始量的 E5hmC-seq 文库生成 CpG 图谱。正义链和反义链上的 CpG 独立计算，在 T2T 基因组中分析出多达 6780 万个可能的 CpG 位点。使用 0.5 ng 至 200 ng 的起始样本时，E5hmC-seq 始终可以覆盖超过 5600 万个 CpG 位点；即使使用 0.1 ng 起始样本时，也可覆盖约 4800 万个位点。

图 7：E5hmC-seq 文库在更高测序深度下表现出高相关性

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采用 methyKit 绘制 1 ng、10 ng 和 200 ng 起始量下 E5hmC-seq 文库之间的相关性，19 亿数据测序深度，150-base reads，最小覆盖度为 1X（所有文库均使用 5,650 万个 CpG 位点）。200 ng 和 10 ng 起始量文库的相关性 ≥ 0.81。200 ng 和 10 ng 起始量文库的相关性 ≥ 0.81。将 200 ng、10 ng 和 1 ng 的 E5hmC-seq 文库逐步向下采样至约 15 亿、11 亿、7 亿和 3 亿的总 reads，并进行相关性分析。我们观察到，与 11 亿、15 亿和 19 亿 reads 相关性相比，3 亿和 7 亿 reads 的相关性较低。结果表明：由于样本中 5hmC 信号的丰度较低，因此需要对 E5hmC-seq 文库进行深度测序。

产品类别:
Methylome Analysis Products,
Next Generation Sequencing Library Preparation Products

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E3350S     Multi-temperature    
        NEBNext® Enzymatic 5hmC-seq Kit E3350-2 -20    
        Control DNA CpG unmethylated Lambda E7123AVIAL -20 1 x 0.024 ml 2 ng/µl
        Control DNA 5hmC T4 E3349AVIAL -20 1 x 0.024 ml 1.5 ng/µl
        NEBNext® Ultra II End Prep Reaction Buffer E7647AVIAL -20 1 x 0.168 ml Not Applicable
        NEBNext® Ultra II End Prep Enzyme Mix E7646AVIAL -20 1 x 0.072 ml Not Applicable
        NEBNext® Ultra™ II Ligation Master Mix E7648AVIAL -20 1 x 0.72 ml Not Applicable
        NEBNext® Ligation Enhancer E7374AVIAL -20 1 x 0.024 ml Not Applicable
        NEBNext® Carrier DNA E3351AVIAL -20 1 x 0.024 ml Not Applicable
        Elution Buffer E7124AVIAL -20 1 x 2.1 ml Not Applicable
        NEBNext® Glucosylation Reaction Buffer E3352AVIAL -20 1 x 0.12 ml Not Applicable
        UDP-Glucose E3353AVIAL -20 1 x 0.024 ml Not Applicable
        T4-BGT E3354AVIAL -20 1 x 0.024 ml Not Applicable
        Stop Reagent E7132AVIAL -20 1 x 0.024 ml Not Applicable
        Deamination Reaction Buffer E3356AVIAL -20 1 x 0.096 ml Not Applicable
        Recombinant Albumin E3357AVIAL -20 1 x 0.024 ml Not Applicable
        APOBEC E7133AVIAL -20 1 x 0.024 ml Not Applicable
        NEBNext® E5hmC-seq™ Adaptor E3366AVIAL -20 1 x 0.06 ml Not Applicable
        NEBNext® Q5U®  Master Mix E3369AVIAL -20 1 x 1.08 ml Not Applicable
        NEBNext® Sample Purification Beads E3355S 25    
        NEBNext® Sample Purification Beads E3355AVIAL 25 1 x 5.2 ml Not Applicable
    • E3350L     Multi-temperature    
        NEBNext® Enzymatic 5hmC-seq Kit E3350-3 -20    
        Control DNA CpG unmethylated Lambda E7123AAVIAL -20 1 x 0.096 ml 2 ng/µl
        Control DNA 5hmC T4 E3349AAVIAL -20 1 x 0.096 ml 1.5 ng/µl
        NEBNext® Ultra II End Prep Reaction Buffer E7647AAVIAL -20 1 x 0.672 ml Not Applicable
        NEBNext® Ultra II End Prep Enzyme Mix E7646AAVIAL -20 1 x 0.288 ml Not Applicable
        NEBNext® Ultra™ II Ligation Master Mix E7648AAVIAL -20 3 x 0.96 ml Not Applicable
        NEBNext® Ligation Enhancer E7374AAVIAL -20 1 x 0.096 ml Not Applicable
        NEBNext® Carrier DNA E3351AAVIAL -20 1 x 0.096 ml Not Applicable
        Elution Buffer E7124AAVIAL -20 1 x 8.6 ml Not Applicable
        NEBNext® Glucosylation Reaction Buffer E3352AAVIAL -20 1 x 0.48 ml Not Applicable
        UDP-Glucose E3353AAVIAL -20 1 x 0.096 ml Not Applicable
        T4-BGT E3354AAVIAL -20 1 x 0.096 ml Not Applicable
        Stop Reagent E7132AAVIAL -20 1 x 0.096 ml Not Applicable
        Deamination Reaction Buffer E3356AAVIAL -20 1 x 0.384 ml Not Applicable
        Recombinant Albumin E3357AAVIAL -20 1 x 0.096 ml Not Applicable
        APOBEC E7133AAVIAL -20 1 x 0.096 ml Not Applicable
        NEBNext® E5hmC-seq™ Adaptor E3366AAVIAL -20 1 x 0.24 ml Not Applicable
        NEBNext® Q5U®  Master Mix E3369AAVIAL -20 1 x 4.32 ml Not Applicable
        NEBNext® Sample Purification Beads E3355L 25    
        NEBNext® Sample Purification Beads E3355AAVIAL 25 1 x 20.64 ml Not Applicable

  • 特性和用法

    需要但不提供的材料

    • Covaris® 仪器以及所需的试管或其它片段化设备
    • NEBNext 表观遗传建库多样本引物试剂盒 2B（Unique 双端 Index 引物）NEB #E3392S（24 次反应）或试剂盒 3 NEB #E3404S（96 次反应）
    • PCR 联管或 96 孔板
    • 甲酰胺（Sigma #F9037-100 ml）、Hi-Di™ 甲酰胺（Thermo Fisher Scientific® #4401457）或 0.1 N NaOH。首选甲酰胺。如果使用 NaOH，请参阅 NEB #E3350“常见问题解答”页面上的“常见问题解答”。
    • 80% 乙醇
    • 1X TE（10 mM Tris-HCl pH 8.0，1 mM EDTA）、低 TE（10 mM Tris-HCl pH 8.0，0.1 mM EDTA）或 10 mM Tris-HCl pH 7.5 或 8.0
    • 无核酸酶水
    • 磁力架/支架，例如 NEBNext 磁性分离架（NEB #S1515）
    • 金属冷却阻断剂，例如 Diversified Biotech®（#CHAM-1000）
    • PCR 仪
    • Agilent® Bioanalyzer®、TapeStation® 或其它片段化分析仪和相关耗材

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    • NEBNext® 酶学转化法甲基化建库试剂盒

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Where can I find protocols for use of the NEBNext® Enzymatic 5hmC-seq Kit? (NEB #E3350)

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE3350

工具 & 资源

  • Web 工具

    • NEBNext Selector

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. What types of samples can be processed using the NEBNext® Enzymatic 5hmC-seq Kit (NEB #E3350) and the NEBNext Enzymatic 5hmC-seq Conversion Module (NEB #E3365)?
    2. What are the recommended inputs for the NEBNext® Enzymatic 5hmC-seq Kit (NEB #E3350) and the NEBNext Enzymatic 5hmC-seq Conversion Module (NEB #E3365)?
    3. What is the difference between the NEBNext® Enzymatic 5hmC-seq Kit (NEB #E3350) and the NEBNext Enzymatic 5hmC-seq Conversion Module (NEB #E3365)?
    4. What buffers are recommended for shearing DNA when using the NEBNext Enzymatic 5hmC-seq Kit and the NEBNext 5hmC-seq Conversion Module?
    5. What is the concentration of the E5hmC-seq™ Adaptor and E5hmC-seq Index Primers?
    6. Why, at some stages of the E5hmC-seq™ protocol, do the NEBNext® Sample Purification Beads behave differently when cleaning up the sample?
    7. What is the expected size of an E5hmC-seq™ library?
    8. How should E5hmC-seq™ libraries be sequenced?
    9. How should E5hmC-seq™ sequencing data be analyzed?
    10. How deep should E5hmC-seq™ libraries be sequenced?
    11. Can the E5hmC-seq™ Adaptor be substituted with another adaptor?
    12. Can the E5hmC-seq™ Adaptor be used for EM-seq™?
    13. Are E5hmC-seq™ libraries directional or non-directional?
    14. Can other buffers be used in place of the supplied Elution Buffer?
    15. What levels of conversion are typical with the control DNAs supplied?
    16. Can enzymatically fragmented DNA be used in E5hmC-seq™?
    17. Can I use NaOH (sodium hydroxide) instead of formamide to denature my DNA prior to the deamination reaction step in the E5hmC-seq protocol?
    18. Do E5hmC-seq™ libraries detect 5mC?
    19. Are Sample Sheets available for use with the NEBNext® Primers for Epigenetics?
    20. Are dual-indexed libraries compatible with single end sequencing?