Taq 高保真 DNA 连接酶 |NEB酶试剂 New England Biolabs

发表于由

上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

Taq 高保真 DNA 连接酶 |

 
Taq 高保真 DNA 连接酶 |

Taq 高保真 DNA 连接酶是经过优化的混合物，由热稳定 DNA 连接酶和专有添加剂组成，能以优异的保真度高效地连接 DNA 切刻位点。在优化的反应缓冲液中，该酶能够催化磷酸二酯键形成，使得与同一互补靶标 DNA 链杂交的两条相邻寡核苷酸链的 5´ 磷酸末端和 3´ 羟基末端通过磷酸二酯键相连，极大程度减少了错配连接（1）。改良的配方使得该产品可以更好地识别连接反应供体和受体，从而能够精确检测 SNP 和其它等位基因变异。Taq 高保真 DNA 连接酶在高温（37 – 75℃）范围内都具有活性（2,3）。

请注意，Taq 高保真 DNA 连接酶适用于依赖高保真切刻连接的分子诊断应用。该酶不能替代 T4 DNA 连接酶，不适用于克隆应用或接头连接/NGS 文库制备。

图 1：Taq 高保真 DNA 连接酶表现出更佳的保真度

Taq 高保真 DNA 连接酶 |
（A）多重底物池示意图。每个底物池都包含一条特定夹板序列、四条上游探针及四条 FAM 标记的下游探针；特定夹板序列与探针互补，在连接酶作用的互补位点处有两个特定碱基 NN（如 AA、AC、AG）。每条探针的连接段为不同碱基，且每条探针的长度各不相同，因而能够在连接反应完成后通过毛细管电泳对产物进行分离与分析。对每条特定夹板序列而言，可供制备的底物池共有 16 个。（B）Ampligase（Epicentre）、Taq DNA 连接酶和 Taq 高保真 DNA 连接酶的连接保真度对比。使用图（A）中列出的多重底物池，在含有 1X 浓度缓冲液的 50 μl 反应液中加入 1 μl 连接酶，进行保真度检测，在 55℃ 条件下温育 30 分钟。横坐标代表某一特定的模板序列，纵坐标代表某一对含有相应碱基的探针连接而成的产物。点代表检测到的某一连接产物（见上图）。从左上到右下的对角线代表完全按照 Watson-Crick 碱基互补配对原则形成的连接产物；所有其它区域代表错配的连接产物。虽然 Taq DNA 连接酶和 Ampligase 在相同反应条件下表现类似，都会产生一定量的错配连接产物，但 Taq 高保真 DNA 连接酶所产生的错配产物明显少，并且可以保持较高的产量（图片修改引用自参考文献 1）。

图 2：Taq 高保真 DNA 连接酶表现出更强的双端错配连接识别能力

Taq 高保真 DNA 连接酶 |
将靶向 λ 整合酶基因中 35 bp 片段的寡核苷酸探针与 16.7 fmol λ 基因组 DNA 一起温育。用 SYBR® Green qPCR 法检测连接产物中的错配率。Taq 高保真 DNA 连接酶（NEB #M0647）显示出比 Taq DNA 连接酶（NEB #M0208）和 Ampligase 更高的保真度，相较于在连接末端出现碱基对错配的产物，与靶标序列完全配对的探针所形成的连接产物的 Δ Ct 值更高。

图 3：Taq 高保真 DNA 连接酶表现出更佳的热稳定性

Taq 高保真 DNA 连接酶 |
Taq 高保真 DNA 连接酶和 Ampligase®（50 µl 反应液中含 1 µl 酶）在相应的 1X 反应缓冲液中，以 80℃ 90 秒/ 94℃ 10 秒的条件，反应多达 100 次循环。连接酶活性测定：连接酶作用于 FAM 标记的切刻双链 DNA 底物，产物经毛细管电泳分析。

图 4：Taq 高保真 DNA 连接酶的连接错配率是 Ampligase 的 1/2

Taq 高保真 DNA 连接酶 |
当上游探针 3´ 末端碱基及互补序列之间配对的 Watson-Crick 碱基对为 C:G 时，连接反应相当困难，使得连接酶更难识别错配连接产物（1）。

产品来源

从大肠杆菌菌株中纯化获得，携带有克隆自极度嗜热生物的连接酶基因。

产品类别:
DNA Ligases Products

应用:
Non-Cloning Ligation,
DNA Ligation

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0647S     -20    
        HiFi Taq DNA Ligase M0647SVIAL -20 1 x 0.05 ml 50 reactions
        HiFi Taq DNA Ligase Reaction Buffer B0647SVIAL -20 1 x 0.5 ml 10 X

  • 特性和用法

    反应条件

    1X Taq 高保真 DNA 连接酶反应缓冲液

    1X Taq 高保真 DNA 连接酶反应缓冲液
    20 mM Tris-HCl
    150 mM KCl
    10 mM MgCl2
    10 mM DTT
    1 mM NAD
    0.1% Triton® X-100
    (pH 8.5 @ 25°C)

    贮存溶液

    10 mM Tris-HCl
    100 mM KCl
    1 mM DTT
    0.1 mM EDTA
    0.1% Triton® X-100
    50% Glycerol
    pH 7.4 @ 25°C

    热失活

    否

  • 优势和特性

    应用特性

    使用连接酶检测反应（LDR）、连接酶链式反应（LCR）（2,4）进行等位基因特异性基因检测。锁式探针连接反应（5）等依赖连接酶的方法。

  • 相关产品

    相关产品

    • Taq DNA 连接酶
    • 9°N™ DNA 连接酶

  • 注意事项

    1. 反应条件：Taq 高保真 DNA 连接酶的反应温度范围为 37 – 75℃。对于某组给定的探针，最佳连接温育温度通常与探针退火区域 Tm 值相差 5℃ 以内。同时在实际应用中，需要根据经验实现活性和保真度的最佳平衡。强烈推荐使用 Thermostable Ligase Reaction Temp Calculator 来计算温育温度。对于经典的 LDR 检测，反应时间通常在 10 – 60 分钟之间，其中 15 分钟反应时间适用于多数应用。对于需要进行变性/退火/连接循环的检测，我们建议在 95℃ 条件下变性 30 s – 1 min，然后以探针组优化后的连接温度退火/连接 1 – 5 分钟。
    2. 1X Taq 高保真 DNA 连接酶反应缓冲液中需要 NAD+ 作为辅因子。10X Taq 高保真 DNA 连接酶反应缓冲液中已含有 NAD+。虽然 10X Taq 高保真 DNA 连接酶缓冲液在 -20℃ 条件下可稳定储存 3 年，但应将反应缓冲液储存在 -80℃ 条件下，以便进一步延长 NAD+ 辅因子的半衰期。
    3. 若需稀释Taq 高保真 DNA 连接酶，之后 -20℃ 贮存，可使用含 50% 甘油的贮存缓冲液（稀释液 A，NEB #B8001），但稀释后的 Taq 高保真 DNA 连接酶的保质期将缩短。如果稀释后立即使用，也可使用 1X Taq 高保真 DNA 连接酶反应缓冲液进行稀释。
    4. 为使 Taq 高保真 DNA 连接酶实现最高保真度，建议配合使用 Taq 高保真 DNA 连接酶反应缓冲液；不过，Taq 高保真 DNA 连接酶也可用 Taq DNA 连接酶反应缓冲液，但酶的活性和保真度会有所下降。相反，如在 Taq 高保真 DNA 连接酶反应缓冲液中使用标准 Taq DNA 连接酶，将提升该酶的保真度。补充 1mM NAD 后，Taq 高保真 DNA 连接酶在多种聚合酶缓冲液中都具有活性，但酶的活性和保真度都将下降。
    5. 在通过凝胶电泳观察连接反应时，可发现某些 DNA 序列可能会因蛋白组分结合而发生凝胶迁移。这种蛋白结合作用不会影响包括扩增在内的绝大多数下游应用。我们建议在凝胶上样之前，使用蛋白酶 K 进行预处理：在 50 μl 连接反应体系中加入 1 μl 蛋白酶 K，37℃ 温育 30 分钟，以避免出现凝胶迁移。
    6. 该连接酶的摩尔浓度为 44 nM。

  • 参考文献

    1. Lohman, G. et al. (2016). Nucleic Acids Res. DOI: 0.1093/nar/gkv898 PubMedID: 44(2):e14
    2. Barany, F. (1991). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 189-193.
    3. Takahashi, M. et al. (1984). J. Biol. Chem. 259, 10041-10047.
    4. Barany, F. (1991). The Ligase Chain Reaction in a PCR World. 5-16.
    5. Nilsson, M., H. Malmgren, M. Samiotaki, M. Kwiatkowski, B. P. Chowdhary and U. Landegren (1994). Padlock probes: circularizing oligonucleotides for localized DNA detection.. Science. 265(5181), 2085-2088.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. HiFi Taq DNA Ligase (M0647) Protocol

工具 & 资源

  • 选择指南

    • DNA Ligase Selection Chart
    • Properties of DNA and RNA Ligases

  • Web 工具

    • NEBcloner®
    • NEBioCalculator®
    • Thermostable Ligase Reaction Temperature Calculator

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. What applications are HiFi Taq DNA Ligase best used for?
    2. Can HiFi Taq DNA Ligase buffer be used with other DNA ligases?
    3. Can HiFi Taq DNA Ligase be used in other buffers?  
    4. What is the optimal reaction temperature for HiFi Taq DNA Ligase?
    5. How much HiFi Taq DNA Ligase is required for a reaction?
    6. How many temperature cycles will HiFi Taq DNA Ligase survive?
    7. Can HiFi Taq DNA Ligase be used for cloning?
    8. Does HiFi Taq DNA Ligase require NAD+?
    9. What is the stability of HiFi Taq DNA Ligase at 95°C?
    10. What is the stability of HiFi Taq DNA Ligase at room temperature?
    11. Why is the HiFi Taq DNA Ligase Buffer brown?
    12. Do thermostable DNA ligases (such as Taq DNA Ligase, 9°N DNA Ligase, and HiFi Taq DNA Ligase) ligate sticky ends?
    13. Does HiFi Taq DNA Ligase have activity on substrates containing RNA?
    14. What is LDR and how does it differ from LCR?
    15. What is LCR and which enzymes do you recommend?
    16. How can I design probes for LDR or LCR to maximize specificity?