切割错配核酸内切酶 I |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

切割错配核酸内切酶 I 是一种依赖 Mg2+ 的 DNA 核酸内切酶，可特异切割错配碱基对（T:T、G:G 和 T:G 错配）。切割错配核酸内切酶 I 在两条链上错配碱基 5´ 端第 3 个磷酸二酯键处切割，切割后产生 5 bp 粘性末端。切割错配核酸内切酶 I 优先切割的 DNA 错配为 T:T、G:G 和 T:G，也可轻松切割 T:I、G:I 和 G:U 错配。此外，实验证明：在 T:C 类型 DNA 错配中，切割错配核酸内切酶 I 可在含 T 的链上形成切刻。该酶还能切割 DNA:RNA 杂交链上的 T:G 和 T:U 错配，但其切割效率低于 DNA:DNA 错配。

图 1：切割错配核酸内切酶 I 能够切割 dsDNA 上的 T:T、G:T 和 G:G 错配。

切割错配核酸内切酶 I |

（A）构建四个在同一位点含特定突变的质粒（p1-p4），使用差异磷酸化引物（正向或反向）扩增生成 8 个双链 PCR 片段，长度约为 672 bp（ds1-ds8）。经 Monarch PCR & DNA 纯化试剂盒（NEB #T1030）纯化后，使用 5 单位 Lambda 核酸外切酶，经 37℃ 温育 60 分钟，特异性地降解双链片段（2.2 µg）中的磷酸化链，从而产生一系列单链（正链/负链）寡核苷酸，同一位点碱基为 A/T/C/G。随后使用 Monarch PCR & DNA 纯化试剂盒（NEB #T1030）对这些单链寡核苷酸（ss1-ss8）进行纯化。

（B）将纯化后的含有 A/T/C/G 的单链寡核苷酸进行混合，可形成精准配对（Watson-Crick 碱基配对）的 DNA（绿色 √ 框）或含单碱基错配的双链 DNA 片段（黄色 X 框）。为了生成含错配碱基的 dsDNA 片段，在下述条件下，选择特定的正链和负链进行混合：在 1X NEBuffer 2.1 中重新退火，加热至 95℃，再冷却至室温。上述实验可产生 8 种 DNA 错配（A:A、A:C、A:G、C:C、C:T、G:G、G:T、T:T）。（C）采用如下方法检测切割错配核酸内切酶 I 切割 dsDNA 中特定错配的能力：在 200 ng 含错配的 dsDNA 中加入 80 单位切割错配核酸内切酶 I，37℃ 温育 30 分钟。然后将产物进行 1.2% 琼脂糖凝胶电泳，再利用溴化乙锭染色进行观察。

图 2：切割错配核酸内切酶 I 能够切割 dsDNA 上的 T:T、G:T 和 G:G 错配。

切割错配核酸内切酶 I |

一条链带有 FAM 荧光标记（蓝色示踪染料）、另一条链带有 ROX 荧光标记（红色示踪染料）的含单碱基错配的 dsDNA 片段与 80 单位切割错配核酸内切酶 I（+M0678），在 NEBuffer r2.1 中，37℃ 条件下温育 30 分钟，以测定切割错配核酸内切酶 I 切割 dsDNA 中特定错配的能力。样本经毛细管电泳分析显示：酶切产物（+M0678 样本）与未经酶处理的样本（-M0678）相比，T:T、G:T 和 G:G 错配的底物峰发生偏移。此外，在 30 分钟内即可看到 T:C 错配中的含 T 链（蓝色链）出现一些轻微切割。该酶在 T:C 错配底物上的切刻活性随着时间的推移而增加（最长 18 小时，数据未显示）。
 

产品来源

An engineered mismatch-specific endonuclease expressed in E. coli.

产品类别:
DNA Repair Enzymes and Structure-specific Endonucleases Products

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0678S     -20    
        Mismatch Endonuclease I M0678SVIAL -20 1 x 0.05 ml 80,000 units/ml
        NEBuffer™ 2.1 B7202SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X

  • 特性和用法

    单位定义

    1 单位指在 20 µl 1X NEBuffer r2.1 总反应体系中，37℃ 条件下，30 分钟切割 50% 的 0.2 pmol 含单个 T:T 错配的荧光标记的 60 mer 双链寡核苷酸所需的酶量。

    反应条件

    1X NEBuffer™ r2.1
    Incubate at 37°C

    NEBuffer™ r2.1
    50 mM NaCl
    10 mM Tris-HCl
    10 mM MgCl2
    100 µg/ml Recombinant Albumin
    (pH 7.9 @ 25°C)

    贮存溶液

    10 mM Tris-HCl
    0.1 mM EDTA
    1 mM DTT
    50% Glycerol
    pH 7.4 @ 25°C

    热失活

    70°C for 5 minutes

  • 优势和特性

    Features

    • 切割 DNA 上的 T:T、G:G 和 T:G 错配
    • 切割 DNA 上的 T:I、G:I 和 G:U 错配
    • 切割 DNA:RNA 上的 T:G 和 T:U 错配
    • T:C 类型 DNA 错配中，在含胸腺嘧啶的链上形成切刻
     

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  • 注意事项

    1. 1 单位指在 20 µl 1X NEBuffer r2.1 反应体系中，37℃ 条件下，30 分钟能切割 50% 的 0.2 pmol 单个 T:T 错配所需的酶量。1 µl 切割错配核酸内切酶 I 含 80 单位，因此，1 µl 切割错配核酸内切酶 I 能够完全切割 8 pmol 的错配 DNA。
    2. 添加分子拥挤试剂（PEG、非特异性 DNA）和某些洗涤剂（Triton X-100）后，切割错配核酸内切酶 I 对某些错配的相对活性可能会增加。

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Protocol for Cleavage of Mismatched DNA (T:T, G:G, T:G) (NEB #M0678)*

工具 & 资源

  • 选择指南

    • Activities of DNA Repair Enzymes and Structure-specific Endonucleases
    • Properties of DNA Repair Enzymes and Structure-specific Endonucleases

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. What is the activity of Mismatch Endonuclease I in other buffers?
    2. Can Mismatch Endonuclease I be inactivated?
    3. What is the activity of Mismatch Endonuclease I at temperatures other than 37°C?
    4. Does Mismatch Endonuclease I require MgCl2?
    5. Can Mismatch Endonuclease I function in the presence of other divalent cations?
    6. Is Mismatch Endonuclease I sensitive to salt?
    7. What mismatched substrates will Mismatch Endonuclease I cleave?
    8. Will Mismatch Endonuclease I cleave consecutive mismatches?
    9. Does Mismatch Endonuclease I cleave mismatches in a DNA/RNA hybrid?
    10. What mismatches will Mismatch Endonuclease I not cleave?
    11. How many picomoles of mismatch DNA can Mismatch Endonuclease I cleave?
    12. How is Mismatch Endonuclease I different than T7 Endonuclease I?
    13. What are the differences between Mismatch Endonuclease I (NEB #M0678) and Authenticase (NEB #M0689)?