Luna® Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

Luna Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒为直接探针法 RNA 检测和定量提供了所有必要的组分，且无需进行 RNA 提取和纯化。Luna Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒包含两个模块：1）Luna Cell Ready 裂解模块（NEB #E3032S）和 2）Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒（NEB #E3006L）。

细胞培养常替代活体生物用于分析基因表达或治疗反应。传统上，人们通过柱提法或化学试剂法从处理过的细胞中提取和纯化 RNA。Luna Cell Ready 裂解模块整合了 DNase I 和 Luna Cell Ready 蛋白酶的功能，仅需 15 分钟即可完成细胞裂解、RNA 释放和基因组 DNA 去除。裂解模块包含独特的 Luna Cell Ready RNA 保护试剂，可在细胞裂解过程中保持 RNA 完整性。50 µl 裂解体系下可对 10 – 100,000 个细胞进行裂解反应。可将多达 2 µl 的裂解物（相当于 0.2 – 4,000 个细胞的 RNA）用于下游 20 µl 体系的 RT-qPCR 反应。与其它 Luna 产品一样，裂解缓冲液包含惰性蓝色示踪染料，使得整个流程可视化。

Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒可兼容大多数实时荧光定量仪器的多个通道，针对目标 RNA 进行探针法实时定量分析。在该试剂盒中，联合使用热启动 Taq DNA 聚合酶与新型 Luna WarmStart 反转录酶，通过适配体可逆抑制来双重控制酶活性。Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒可以直接对 Luna Cell Ready 裂解模块制备的细胞裂解物中的 RNA 转录本进行检测和定量（单重或多重反应）。

兼容 Luna Cell Ready 裂解模块的细胞系如下表所示。这些细胞进行 5 个 10 倍梯度稀释（在 50 µl 体系中裂解 10 – 100,000 个细胞），并取 1 µl 裂解物在 20 µl 体系中进行一步法 RT-qPCR 反应。每个细胞系的线性结果区域显示在最后一列。此外，上述裂解模块经测试也可用于一些昆虫细胞系。

表 1：验证过的细胞系
 

细胞系 特性 种属 50 μl 裂解体系中的细胞数量
A549 贴壁培养 人肺癌细胞 10 – 100,000
HEK293 贴壁培养 人肾脏细胞 10 – 100,000
HeLa 贴壁培养 人子宫颈腺癌细胞 10 – 100,000
HepG2 贴壁培养 人肝脏癌细胞 10 – 1,000
NCI-H460 贴壁培养 人肺癌细胞 10 – 100,000
SK-N-SH 贴壁培养 人脑成神经细胞瘤细胞 10 – 10,000
U2Os 贴壁培养 人骨骼骨肉瘤细胞 10 – 100,000
Jurkat 悬浮培养 人 T 淋巴细胞白血病细胞 10 – 100,000
K-562 悬浮培养 人成淋巴细胞白血病细胞 10 – 100,000
图 1：Luna Cell Ready 一步法 RT-qPCR 实验流程

Luna® Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒 |

Luna Cell Ready 一步法 RT-qPCR 试剂盒提供了直接从培养细胞（50 µl 体系可裂解高达 100,000 个细胞）中进行 RNA 检测和定量的所有必要组分。Luna Cell Ready 裂解模块整合了 DNase I 和 Luna Cell Ready 蛋白酶的功能，仅需 15 分钟即可完成细胞裂解、RNA 释放和基因组 DNA 去除。可将多达 2 µl 裂解物（相当于 0.2 – 4,000 个细胞的 RNA）用于下游 20 µl 体系的 RT-qPCR 反应。
图 2：Luna Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒可直接对浓度范围跨越 5-log 的细胞裂解物进行灵敏精准的 RNA 定量。

Luna® Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒 |

梯度稀释的 HeLa 细胞（100,000 – 10）使用标准反应条件（37℃ 裂解 10 分钟，25℃ 灭活 5 分钟），在 50 µl 的 Luna Cell Ready 裂解体系（NEB #E3032）中裂解。使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒（NEB #E3006），加入 1 μl 细胞裂解物（相当于在 20 µl RT-qPCR 反应体系中加入 0.2 – 2,000 个细胞）对目的基因进行定量，对每个浓度的样品都做了重复。结果展示了两个高丰度靶标：β-actin（Texas Red）和 GAPDH（FAM），一个低丰度靶标：RPL32（HEX）的多重检测结果（A）和单重检测结果（B）。图中显示了相应的扩增效率（E）和线性关系（R2）。（C）对三个靶标多重和单重检测的 Cq 值重叠，证明了这些结果的一致性。
图 3：Luna Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒可对 5-log 细胞浓度范围的样品进行精准可靠的 RNA 定量，与提纯后 RNA 获得的结果相当。
Luna® Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒 |
梯度稀释的 A549 细胞（100,000 – 10）使用标准反应条件（37℃ 裂解 10 分钟，25℃ 灭活 5 分钟），在 50 µl 的 Luna Cell Ready 裂解体系（NEB #E3032）中裂解。也可使用柱提法 RNA 提取试剂盒提纯 RNA。A：使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒（NEB＃E3006），将 1 μl 细胞裂解物（实心圆，左）或纯化的 RNA（空心圆，右）作为起始样本（相当于 20 µl RT-qPCR 反应体系中加入 0.2 – 2,000 个细胞），对目的基因进行定量，对每个样品浓度都做了重复实验。在 5-log 细胞起始加入量范围内，检测高丰度靶标 β-actin 和两个低丰度靶标 ARF3 和 Tubulin 的结果如图所示。每个靶标的扩增效率（E）在图中左下方显示。
图 4：Luna Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒的扩增效率及灵敏度均优于其它市售的细胞裂解一步法 RT-qPCR 试剂盒。
Luna® Cell Ready 探针一步法 RT-qPCR 试剂盒 |
梯度稀释的 A549 细胞（100,000 – 10）使用标准反应条件，在 50 µl 的 Luna Cell Ready 裂解体系（NEB #E3032）中裂解。或者，参照相应厂家产品说明书，使用市售的 Bio-Rad（SingleShot™ Probes One-Step Kit for Cell Lysis and RT-qPCR，#172-5070）、Qiagen（FastLane Cell Probe Kit，#216413）和 Thermo Fisher（Cells-to-CT 1-Step TaqMan Kit，A25603）试剂盒，裂解同样数量的细胞。然后使用每个试剂盒中的一步法 RT-qPCR 模块，加入 1 μl 细胞裂解物（相当于 20 µl RT-qPCR 反应体系中加入 0.2 – 2,000 个细胞），对目的基因进行定量，对每个浓度的样品都做了重复。在 5-log 浓度范围内，使用各试剂盒对β-actin（Tye）、GAPDH（FAM）和 RPL32（Cy5）进行多重扩增检测，结果如图所示。为了使结果标准化，将总荧光值的 10%（Tye）、5%（FAM）、15%（Cy5）设置为阈值。图中显示了扩增效率（E）及最高与最低起始量的 Cq 值。
产品类别:
Luna® qPCR & RT-qPCR Products,
PCR, qPCR & Amplification Technologies Products

应用:
qPCR & RT-qPCR,
DNA Amplification, PCR & qPCR

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E3031S     -20    
        Luna Cell Ready Lysis Buffer B8036AVIAL -20 2 x 1.4 ml 2 X
        Luna Cell Ready RNA Protection Reagent M0469AVIAL -20 1 x 0.25 ml 25 X
        Luna Cell Ready Protease M0473AVIAL -20 1 x 0.2 ml 25 X
        Luna Cell Ready Stop Solution B8037AVIAL -20 1 x 0.6 ml 10 X
       

      DNase I (RNase-free)

      		 M0474AVIAL -20 1 x 0.5 ml 10 X
        Luna® WarmStart® RT Enzyme Mix M3002LVIAL -20 1 x 0.5 ml 20 X
        Luna® Universal Probe One-Step Reaction Mix M3006SVIAL -20 5 x 1 ml 2 X
        Nuclease-free Water B1502AVIAL -20 3 x 1.5 ml Not Applicable

  • 特性和用法

    需要但不提供的材料

    • 磷酸盐缓冲液（PBS）
    • 靶标特异性引物
    • 细胞
    • Eppendorf 管
    • PCR 联管
    • PCR 板
    • qPCR 仪器
    • 移液器和移液枪头（为减少交叉污染，应使用带滤芯的枪头）

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Protocol for Luna® Cell Ready Probe One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3031)

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE3031

  • 应用实例

    • High-throughput qPCR and RT-qPCR Workflows Enabled by Beckman Coulter Echo Acoustic Liquid Handling and NEB Luna Reagents

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. What cell lines are compatible with the Luna Cell Ready Probe One-Step RT-qPCR Kit (NEB #3031)?
    2. How many cells should I use for reliable detection?
    3. How many cells should I seed into cell culture plates to achieve optimal detection?
    4. Can cryopreserved cell lines or pelleted cells stored at -80°C be used with this kit? 
    5. How can lysis efficiency be determined?
    6. Why is it important to evaluate RNA damage or inhibition during cell lysis and one-step RT-qPCR detection?
    7. What is the “Luna Cell Ready RNA Protection Reagent” and when should it be used?
    8. Should I include a No-RT control reaction?
    9. Will the blue tracking dye interfere with detection?
    10. Is cell washing prior to lysis necessary?
    11. Which lysis format should I use?
    12. What protocol should be used for cell lysis? Can cells be lysed at room temperature or using a short protocol?
    13. When using cell lysates generated from Luna Cell Ready Lysis Module, can RT-qPCR experiments be set up at room temperature?
    14. How much cell lysate should I use as input? (NEB #3031)
    15. Can I use the cell lysates generated from the Luna Cell Ready Lysis Module for two-step RT-qPCR? 
    16. Why does the Luna Cell Ready Probe One-Step RT-qPCR Kit contain more RT-qPCR reactions than lysis reactions?
    17. If either the Luna Cell Ready Lysis Module or Luna Cell Ready Probe One-Step RT-qPCR Kit runs out can I order them separately?
    18. How can I obtain more technical help related to Luna Cell Ready Probe One-Step RT-qPCR Kit?