ProtoScript® cDNA 第一链合成试剂盒 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

ProtoScript® cDNA 第一链合成试剂盒含两种经优化的混合液：M-MuLV 酶混合液和 M-MuLV 反应混合液。M-MuLV 酶混合液含 M-MuLV 反转录酶和小鼠 RNase 抑制剂，M-MuLV 反应混合液含 dNTP 和经优化的缓冲液。该试剂盒还包含两种优化的反转录引物和无核酸酶水。锚定的 Oligo-dT 引物 [d(T)23VN] 迫使引物与 polyA 尾的起始端退火。经优化的随机引物混合液能随机并持续性地与整个 RNA 模板配对，包括 mRNA 和无 polyA 尾的 RNA。合成的第一链 cDNA 产物长度可超过 10 kb（图 1）。

成功合成 cDNA 的要素：

RNA 模板
高纯度的完整 RNA 对于灵敏的 RT-PCR 检测至关重要。RNA 的 A260/A280 比值应至少 1.7 或更高。

总 RNA 或 mRNA 均可用于反转录反应。总 RNA 通常足以进行大多数 RT-PCR 分析。不过，如果需要，可以使用 PolyA Spin mRNA 分离试剂盒（NEB #S1560）或 mRNA 磁性分离试剂盒（NEB #S1550）获得 mRNA。

检测所需的 RNA 量取决于目标转录本的丰度。通常推荐使用 1 ng 至 1 μg 的总 RNA 或 0.1-100 ng 的 mRNA。

cDNA 第一链合成反应
RNA 和引物在 70℃ 条件下变性 5 分钟，可以去除阻碍较长 cDNA 合成的二级结构。不过，可以在某些情况下省略此步骤（结果未发表）。

推荐在 42℃ 条件下温育一小时，以获得最高产量和最大长度。不过，许多靶标用较短的温育时间即可进行检测。例如，对于 2 kb cDNA 合成，温育 5 分钟就足够了。

选择反转录引物
Oligo d(T) 引物是大多数实验的首选，因为它确保所有 cDNA 拷贝在 mRNA 的 3´ 端终止并产生最长的连续 cDNA。锚定的 Oligo-dT 引物 [d(T)23VN] 迫使引物与 polyA 尾的起始端退火，从而防止在 polyA 尾的内部位点开始退火（1）。不过，如果需要，也可以选择另外两种引物。

随机引物混合液是经优化的六聚体和 d(T)23VN 引物混合液。该混合液能随机地与整个 RNA 模板配对，包括 mRNA 和无 polyA 尾的 RNA（例如核糖体 RNA）。随机引物混合液产生的 cDNA 平均长度较短，可用于检测多个短 RT-PCR 产物。随机引物混合液在各种 RNA 模板中均具有良好的性能。

基因特异引物用于 cDNA 合成反应时，cDNA 产物只能用于扩增该转录本。RNA 起始量较低（低于 10 ng）且只需要一种特定的 cDNA 时，使用这种方法可以获得良好的结果。

推荐的引物浓度：
引物：终浓度
OLIGO d(T)23VN：5 μM
随机引物混合液：6 μM
特异引物：0.1–1 μM

图 1： ProtoScript® cDNA 第一链合成试剂盒 |
以 2 μg 人脾总 RNA 为模板，在 42℃ 条件下，使用 1X M-MuLV 酶混合液合成 cDNA 第一链。阴性对照反应使用 1X M-MuLV 反应混合液进行。以部分 cDNA 第一链产物为模板，使用 1X LongAmp™ Taq 2X 预混液（NEB #M0287）扩增三种不同 mRNA 的特异序列。泳道 1：β 肌动蛋白基因的 1.1 kb 片段。泳道 2：β 肌动蛋白基因 1.1 kb 片段的 noRT 对照。泳道 3：Xrn-1 基因的 4.7 kb 片段。泳道 4：Xrn-1 基因 4.7 kb 片段的 noRT 对照。泳道 5：鸟嘌呤核苷酸交换因子 p532 的 9.8 kb 片段。泳道 6：鸟嘌呤核苷酸交换因子 p532 9.8 kb 片段的 noRT 对照。Marker M 为 1 kb Plus DNA Ladder（NEB #N3200）。
产品类别:
RT-PCR Products,
cDNA Synthesis & Reverse Transcriptases Products

应用:
cDNA Synthesis,
Reverse Transcription (cDNA Synthesis),
RT-PCR & cDNA Synthesis,

PCR

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E6300S     -20    
        M-MuLV Enzyme Mix M0342AVIAL -20 1 x 0.06 ml 10 X
        M-MuLV Reaction Mix M0343AVIAL -20 1 x 0.4 ml 2 X
        Random Primer Mix S1330AVIAL -20 1 x 0.07 ml 60 µM
        Oligo d(T)23 VN S1332AVIAL -20 1 x 0.07 ml 50 µM
        Nuclease-free Water B1502AVIAL -20 1 x 1.5 ml Not Applicable
    • E6300L     -20    
        M-MuLV Enzyme Mix M0342AVIAL -20 5 x 0.06 ml 10 X
        M-MuLV Reaction Mix M0343AVIAL -20 5 x 0.4 ml 2 X
        Random Primer Mix S1330AVIAL -20 5 x 0.07 ml 60 µM
        Oligo d(T)23 VN S1332AVIAL -20 5 x 0.07 ml 50 µM
        Nuclease-free Water B1502AVIAL -20 5 x 1.5 ml Not Applicable

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    • LongAmp® Taq 2X 预混液
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  • 参考文献

    1. Liao, J. and Greg, Z. (1997). Biotechniques. 23, 368-370.
    2. Sambrook, J. and Russel, D.W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). (pp. 8.46-8.53 and 11.37-11.42). Cold Spring Harbor.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. First Strand cDNA Synthesis Protocols (E6300)

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE6300

  • 使用指南

    • cDNA/Reverse Transcriptase Tips

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. How do I choose between LunaScript RT SuperMix Kit and ProtoScript first strand cDNA synthesis kits?
    2. Why am I getting a low yield of cDNA?