蛋白磷酸化研究的预制胶

SuperSep Phos-tag™

　　SuperSep Phos-tag™是研究蛋白磷酸化的方法，无需特异性磷酸化抗体或者同位素标记。

◆SuperSep Phos-tag™

　　Phos-tag™是一种预制胶，预先加入了50 μmol/L的Phostag™ Acrylamide，打开包装即可直接使用。预制胶中含有锌作为金属离子，在中心凝胶缓冲液中保存稳定性很好，得到的带条结果也很整齐。

　　磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白作为不同条带分离。

　　分离后，胶可用于考马斯亮蓝染色，免疫印迹和质谱实验。

◆Phos-tag™ SDS-PAGE 的原理

◆在HighWire Search 上搜索到的论文数

◆运用

利用p35的丙氨酸突变体确定Cdk5 激活p35的磷酸化位点

　　p35常见的磷酸化位点是Ser8和Thr138。但是Ser8和Thr138位点往往会发生丙氨酸突变，产生3种突变体（Ser8突变体：S8A，Thr138突变体：T138A，Ser8和Thr138双突变体：2A）。这3种突变体、野生型p35、Cdk5和没有激酶活性的Cdk5都来源于COS-7细胞。这些细胞裂解液用Phos-tag™ SDS-PAGE和Western blotting 进行检测（检测抗体：p35抗体）。

100 μM Phos-tag ™ 丙烯酰胺, 7.5% 聚丙烯酰胺凝胶

可明确磷酸化位点和条带迁移率的关系！

– 泳道1（条带L2和L4）和泳道5（条带M1）：p35在Cdk5的作用下发生了磷酸化；

– 泳道1（条带L2和L4）和泳道3（条带L2和L4）：在无激酶活性Cdk5的作用下，大约有一半p35蛋白在Thr138位点

发生磷酸化，同样在138位发生突变的p35蛋白亦是如此。

– 泳道5 （条带M1）和泳道6（条带L3和L4）：Ser8和Thr138是主要的磷酸化位点；

– 泳道5（条带M1）、泳道7（条带L1和L2）和泳道8（条带M2）：条带M1是Ser8和Thr138都发生磷酸化的条带；

条带M2是只有Ser8磷酸化的条带；条带L1和L2是只有Thr138磷酸化的条带。

※ 条带L1和L3中的X 是不确定哪个位点发生磷酸化的条带；

※ 条带L4是非磷酸化的p35。

【参考文献】

▪ Quantitative Measurement of in Vivo Phosphorylation States of Cdk5 Activator p35 by Phos-tag ™ SDS-PAGE. T. Hosokawa, T. Saito, A. Asada, K. Fukunaga, and S. Hisanaga,Mol. Cell. Proteomics, Jun 2010;9: 1133 – 1143.

【结果提供】

理化学研究所 脑科学综合研究中心 回路功能研究核心 记忆功能研究团队 细川智永（Dr. T. Hosokawa）

首都大学东京 理工学研究科 生命科学专业 神经分子功能研究室 久永真市（Dr. S. Hisanaga）

检测含有Dnmt1磷酸化激酶的片段

我们可以确定在片段中含有目的激酶！

① 采用亲和色谱法从鼠脑提取液中纯化GST-Dnmt1（1-290）结合蛋白

② 使用0.3 M 和1 M NaCl 的DNA 纤维素柱洗脱得到目的蛋白

③ GST-Dnmt1（1-290）作为体外激酶实验的反应底物

④ Phos-tag ™ SDS-PAGE 用于Western blotting，确定迁移条带中每个片段的激酶活性

【参考文献】

▪ The DNA-binding activity of mouse DNA methyltransferase 1 is regulated by phosphorylation with casein kinase 1delta/epsilon. Y. Sugiyama, N. Hatano, N. Sueyoshi, I. Suetake, S. Tajima, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, T. Koike, and I. Kameshita, Biochem. J.,

【结果提供】

高知大学 综合研究中心 生命、功能物质部门 实验实习机器设施 杉山康宪（Dr. Y. Sugiyama）

香川大学 农学部 应用生物科学科 动物功能生化学研究室 龟下勇（Dr. I. Kameshita）

二维电泳中的应用：分析hnRNP K磷酸化异构体

　　小鼠巨噬细胞J774.1 经LPS 刺激后，裂解细胞，经过免疫沉淀法分离得到hnRNP K。在二维电泳中，一维是IPG 胶，二维是Phos-tag ™ SDS-PAGE，可分离hnRNP K 的异构体。利用质谱仪，可以确认不同的点代表不同的亚型或修饰蛋白。

同一个等电点的位置上，不同位点发生磷酸化都可以被区分开来

（例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7）

【参考文献】

▪ Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity electrophoresis. Y. Kimura, K. Nagata, N Suzuki, R. Yokoyama, Y. Yamanaka, H. Kitamura, H. Hirano, and O. Ohara, Proteomics, Nov 2010; 10(21): 3884-95.

【结果提供】

横滨市立大学 生命纳米系统科学研究科 生物体超分子系统科学专业 木村弥生（Dr. Y. Kimura）、平野久（Dr. H. Hirano）

理化学研究所RCAI 小原收

◆备注

样品制备：

Phos-tag SDS-PAGE对于蛋白样品中的杂质非常敏感，尤其是螯合剂，钒酸，无机盐，表面活性剂这类物质。

强烈建议在Phos-tag SDS-PAGE之前通过TCA沉淀或渗析法降低杂质含量。

转膜前处理：

另一个必须的步骤是在转膜前，用EDTA去除凝胶中的金属离子（Mn2+或者Zn2+）；

该步骤可提高蛋白的转膜效率。

●　分别准备10 mmol/L 含EDTA和不含EDTA 两种1x transfer buffer。

●　将凝胶浸泡在含10 mmol/L EDTA的1x transfer buffer，至少20分钟，温和摇晃。更换新缓冲液，重复3次。

●　将凝胶浸泡在不含10 mmol/L EDTA的1x transfer buffer，10分钟，温和摇晃。

●　转膜操作*。

* 建议用湿法转膜，以提高转膜效率。

◆质量控制

　　每一批SuperSep Phos-tag™，出厂前均根据其产品规格进行测试，以保证可分离磷酸化和非磷酸化蛋白，以及他们的分离成都在正常参数内。

◆产品信息

用于Bio-Rad伯乐电泳仪

用于Life Technologies电泳仪