Next® 5hmC 甲基化建库酶学转化法模块 |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

NEBNext 5hmC 甲基化建库酶学转化法模块使用高效的酶学转化法，实现在单碱基水平上特异性检测 5hmC 位点。在 E5hmC-seq 两步酶法转化过程中，T4-BGT 对 5hmC 进行糖基化，使得 5hmC 在下一步 APOBEC 脱氨基反应中被保护了起来。T4-BGT 不保护 5mC 和未甲基化的胞嘧啶，它们被 APOBEC 脱氨基为尿嘧啶。

在针对 Illumina 测序平台制备 E5hmC-seq 文库时，推荐使用包含文库制备试剂的 NEBNext 酶学转化法 5hmC 甲基化建库试剂盒（NEB #E3350）

图 1：E5hmC-seq 转化原理

Next® 5hmC 甲基化建库酶学转化法模块 |

为了实现特异性的 5hmC 检测，首先使用 T4-BGT 对 5hmC 进行糖基化。然后，5mC 和未修饰的胞嘧啶在 APOBEC 的作用下，分别脱氨基生成胸腺嘧啶和尿嘧啶，而受保护的 5hmC 则未被转化。
产品类别:
Methylome Analysis Products,
Next Generation Sequencing Library Preparation Products

  • 试剂盒组成

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • E3365S     -20    
        Control DNA CpG unmethylated Lambda E7123AVIAL -20 1 x 0.024 ml 2 ng/µl
        Control DNA 5hmC T4 E3349AVIAL -20 1 x 0.024 ml 1.5 ng/µl
        NEBNext® Carrier DNA E3351AVIAL -20 1 x 0.024 ml Not Applicable
        Elution Buffer E7124AVIAL -20 1 x 2.1 ml Not Applicable
        NEBNext® Glucosylation Reaction Buffer E3352AVIAL -20 1 x 0.12 ml Not Applicable
        UDP-Glucose E3353AVIAL -20 1 x 0.024 ml Not Applicable
        T4-BGT E3354AVIAL -20 1 x 0.024 ml Not Applicable
        Stop Reagent E7132AVIAL -20 1 x 0.024 ml Not Applicable
        Deamination Reaction Buffer E3356AVIAL -20 1 x 0.096 ml Not Applicable
        Recombinant Albumin E3357AVIAL -20 1 x 0.024 ml Not Applicable
        APOBEC E7133AVIAL -20 1 x 0.024 ml Not Applicable
    • E3365L     -20    
        Control DNA CpG unmethylated Lambda E7123AAVIAL -20 1 x 0.096 ml 2 ng/µl
        Control DNA 5hmC T4 E3349AAVIAL -20 1 x 0.096 ml 1.5 ng/µl
        NEBNext® Carrier DNA E3351AAVIAL -20 1 x 0.096 ml Not Applicable
        Elution Buffer E7124AAVIAL -20 1 x 8.6 ml Not Applicable
        NEBNext® Glucosylation Reaction Buffer E3352AAVIAL -20 1 x 0.48 ml Not Applicable
        UDP-Glucose E3353AAVIAL -20 1 x 0.096 ml Not Applicable
        T4-BGT E3354AAVIAL -20 1 x 0.096 ml Not Applicable
        Stop Reagent E7132AAVIAL -20 1 x 0.096 ml Not Applicable
        Deamination Reaction Buffer E3356AAVIAL -20 1 x 0.384 ml Not Applicable
        Recombinant Albumin E3357AAVIAL -20 1 x 0.096 ml Not Applicable
        APOBEC E7133AAVIAL -20 1 x 0.096 ml Not Applicable

  • 特性和用法

    需要但不提供的材料

    • 如果 DNA 需要进行片段化，请使用：NEBNext UltraShear™（NEB #M7634）或 Covaris® 仪器以及所需的试管或其它片段化设备
    • PCR 联管或 96 孔板
    • 纯化磁珠：SPRIselect™ 试剂盒（Beckman Coulter® 公司，#B23317）或 AMPure® XP 磁珠（贝克曼库尔特公司，#A63881）或其它磁珠制造商。
    • 甲酰胺（Sigma #F9037-100 ml）、Hi-Di™ 甲酰胺（Thermo Fisher Scientific® #4401457）或 0.1 N NaOH。首选甲酰胺。如果使用 NaOH，请参阅 NEB #E3365“常见问题解答”页面上的“常见问题解答”。
    • 80% 乙醇
    • 1X TE（10 mM Tris-HCl pH 8.0，1 mM EDTA）、低 TE（10 mM Tris-HCl pH 8.0，0.1 mM EDTA）或 10 mM Tris-HCl pH 7.5 或 8.0
    • 无核酸酶水
    • 磁力架/支架，例如 NEBNext 磁性分离架（NEB #S1515）
    • 金属冷却阻断剂，例如 Diversified Biotech®（#CHAM-1000）
    • PCR 仪
    • Agilent® Bioanalyzer®、TapeStation® 或其它片段化分析仪和相关耗材

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    • NEBNext® 表观遗传建库多样本引物试剂盒 2B（Unique 双端 Index 引物）
    • NEBNext® 表观遗传建库多样本引物试剂盒 3（Unique 双端 Index 引物）
    • NEBNext® 甲基化建库酶学转化法模块

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Where can I find protocols for use of the NEBNext® Enzymatic 5hmC-seq Conversion Module (NEB #E3365)?

  • 说明书

    产品说明书包含产品使用的详细信息、产品配方和质控分析。

    • manualE3365

工具 & 资源

  • Web 工具

    • NEBNext Selector

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. What types of samples can be processed using the NEBNext® Enzymatic 5hmC-seq Kit (NEB #E3350) and the NEBNext Enzymatic 5hmC-seq Conversion Module (NEB #E3365)?
    2. What are the recommended inputs for the NEBNext® Enzymatic 5hmC-seq Kit (NEB #E3350) and the NEBNext Enzymatic 5hmC-seq Conversion Module (NEB #E3365)?
    3. What is the difference between the NEBNext® Enzymatic 5hmC-seq Kit (NEB #E3350) and the NEBNext Enzymatic 5hmC-seq Conversion Module (NEB #E3365)?
    4. What buffers are recommended for shearing DNA when using the NEBNext Enzymatic 5hmC-seq Kit and the NEBNext 5hmC-seq Conversion Module?
    5. Why, at some stages of the E5hmC-seq™ Conversion Module protocol, do the NEBNext® Sample Purification Beads behave differently when cleaning up the sample?
    6. What levels of conversion are typical with the control DNAs supplied?
    7. Can enzymatically fragmented DNA be used in E5hmC-seq™?
    8. Can I use NaOH (sodium hydroxide) instead of formamide to denature my DNA prior to the deamination reaction step in the E5hmC-seq protocol?