虾碱性磷酸酶（rSAP） |NEB酶试剂 New England Biolabs

发表于由

上海金畔生物科技有限公司代理New England Biolabs（NEB）酶试剂全线产品，欢迎访问官网了解更多产品信息和订购。

产品信息

虾碱性磷酸酶（rSAP）是一种不耐热的碱性磷酸酶，重组表达后纯化得到。rSAP 与野生型酶相同，不含亲和标签或其它修饰。rSAP 可以非特异性催化 DNA 和 RNA 的 5´ 和 3´ 末端磷酸单酯的去磷酸化。另外，rSAP 还水解核糖核苷酸和脱氧核糖核苷三磷酸（NTP 和 dNTP）。rSAP 在许多分子生物学应用中有着重要作用，例如去除 DNA 和 RNA 的磷酸化末端用于后续的克隆或探针末端标记。在克隆中，对线性化质粒 DNA 去磷酸化，可防止自连。该酶作用于 5´ 突出端、5´ 凹陷端和平末端。rSAP 也可以用来降解 PCR 反应中的游离 dNTP，用于制备 DNA 测序和 SNP 分析模板。rSAP 在 65℃ 下加热 5 分钟即可完全且不可逆地失活，因此无需在连接或末端标记前去除 rSAP。

图 1：rSAP 在 65℃ 下热失活

虾碱性磷酸酶（rSAP） |

在推荐反应条件下温育 1 单位的 rSAP（包括 DNA）30 分钟，然后在 65℃ 下加热。采用 PNPP 检测法测定剩余的磷酸酶活性。

 

产品来源

源自毕赤酵母（Pichia pastoris），克隆有来自北极虾（Pandalus borealis）的虾碱性磷酸酶基因（1,2）。

产品类别:
Phosphatases Products

应用:
Dephosphorylation

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M0371V     -20    
        Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) M0371VVIAL -20 1 x 0.25 ml 1,000 units/ml
        rCutSmart™ Buffer B6004SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X
    • M0371S     -20    
        Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) M0371SVIAL -20 1 x 0.5 ml 1,000 units/ml
        rCutSmart™ Buffer B6004SVIAL -20 1 x 1.25 ml 10 X
    • M0371L     -20    
        Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) M0371LVIAL -20 2 x 1.25 ml 1,000 units/ml
        rCutSmart™ Buffer B6004SVIAL -20 2 x 1.25 ml 10 X

  • 特性和用法

    单位定义

    1 单位指在 1 ml 总反应体系中，37℃ 条件下，1 分钟水解 1 μmol 对硝基苯磷酸盐（PNPP）（NEB #P0757）所需的酶量。

    反应条件

    1X rCutSmart™ 缓冲液
    Incubate at 37°C

    1X rCutSmart™ 缓冲液
    50 mM Potassium Acetate
    20 mM Tris-acetate
    10 mM Magnesium Acetate
    100 µg/ml Recombinant Albumin
    (pH 7.9 @ 25°C)

    贮存溶液

    25 mM Tris-HCl
    1 mM MgCl2
    50% Glycerol
    pH 7.5 @ 25°C

    热失活

    65°C for 5 minutes

    分子量

    理论上的: 54 kDa

    单位活性检测条件

    1 M 二乙醇胺-HCl（pH 9.8）、0.5 mM MgCl2、50 mM 对硝基苯磷酸盐。这些条件仅用于定量酶活性。

  • 优势和特性

    应用特性

    • DNA 和 RNA 的 5´ 与 3´ 末端的去磷酸化。
    • 克隆载体 DNA 去磷酸化，防止载体自连。
    • 在使用 T4 多聚核苷酸激酶（T4 PNK）标记末端前对 DNA 进行去磷酸化。
    • 在测序或 SNP 分析前去除 PCR 反应中的 dNTP。

  • 相关产品

    相关产品

    • T4 DNA 连接酶
    • 快速连接™试剂盒
    • 瞬时粘性末端连接酶预混液
    • 平末端/TA 连接酶预混液
    • t1010-monarch-plasmid-miniprep-kit
    • Monarch® DNA 胶回收试剂盒
    • Monarch® PCR & DNA 纯化试剂盒（5 μg）

  • 注意事项

    1. 与大多数碱性磷酸酶一样，rSAP 是一种 Zn2+ 和 Mg2+ 依赖型酶。在我们的制剂中，锌离子被紧密结合在活性中心，因此无需补充锌离子或其它添加剂。
    2. rSAP 在 1X NEBuffer 1.1、2.1、3.1 以及 NEBuffer 1、2、3、4 和用于 EcoRI 的 NEBuffer 中均有活性。
    3. 添加一价盐后 rSAP 的活性提高。
    4. 金属螯合剂（如 EDTA）、无机磷酸盐和磷酸盐类似物会抑制 rSAP。
    5. 添加还原剂（DTT、β-ME）后 rSAP 的活性降低。
    6. 分子量：rSAP 是同源二聚体。单体分子量为 54 kDa。

  • 参考文献

    1. Olsen, R. L. et al. (1991). Comp. Biochem. Physiol. 99B(4):, 755-761.
    2. Nilsen, I.W. et al. (2001). Comp. Biochem. Physiol. 129B(4):, 853-861.

操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Protocol for Dephosphorylation of 5´-ends of DNA using rSAP (NEB #M0371)
    2. Enzymatic PCR Cleanup Protocol (NEB #M0371)

  • 使用指南

    • Activity of DNA Modifying Enzymes in rCutSmart™ Buffer

  • 应用实例

    • Enzymatic PCR cleanup using Exonuclease I and Shrimp Alkaline Phosphatase

工具 & 资源

  • 选择指南

    • NEB Diluent and Buffer Table
    • Phosphatase Selection Chart

  • Web 工具

    • NEBcloner®

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. Which alkaline phosphatase, Quick CIP, rSAP or Antarctic Phosphatase works best?
    2. The number of colonies that do not contain an insert seems high. How can I tell if rSAP worked?
    3. What phosphate groups are removed by rSAP, Quick CIP, or Antarctic Phosphatase (AnP)?
    4. Does the DNA need to be purified after rSAP treatment?
    5. How stable is rSAP in its storage buffer at various temperatures?
    6. What is the effect of metal chelators, inorganic phosphate and phosphate analogs on rSAP activity?
    7. What is the effect of reducing agents on rSAP activity?
    8. Will Quick CIP, rSAP or Antarctic Phosphatase (AnP) dephosphorylate proteins?
    9. Can rSAP be heat inactivated?
    10. Does the DNA need to be purified after a restriction digest and prior to the dephosphorylation step?
    11. Does the DNA need to be purified after the dephosphorylation step and prior to the ligation step?
    12. Are the alkaline phosphatases active in NEBuffers?
    13. Cloning Problem: Too much background in the transformation step.
    14. Can you tell me more about the switch from BSA to Recombinant Albumin (rAlbumin) in NEBuffers?