Luna® 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG（无 ROX） |NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品信息

Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG（无 ROX）用于探针法实时荧光定量检测靶标 RNA。首先反转录酶将 RNA 转化为 cDNA，然后 DNA 聚合酶对 cDNA 进行扩增，完成靶标的实时荧光定量 PCR（qPCR），整个过程在单管内一次性完成。基于探针法的 qPCR / RT-qPCR 原理是利用聚合酶的 5´ → 3´ 外切酶活性，将淬灭的目标特异性探针切断发出荧光，并实时监测荧光值的增加，以测量每个循环中的 DNA 扩增。在荧光信号显著超过背景荧光的位置，可以确定 Cq 值。Cq 值可用于评估两个或多个样品的靶基因相对丰度。

Luna 探针一步法 RT-qPCR 预混液，含 UDG（无 ROX）为 4X 浓度，因此在靶标 RNA 量极低的应用中（例如：病原体检测），可提高样品加入量。通过对 5 个靶标进行不同浓度的线性、灵敏度检测，显示该产品在多重检测中性能更优。该预混液将一步法 RT-qPCR 所需组分整合到单个试管中，包括：Luna 温启动反转录酶、Taq 热启动 DNA 聚合酶、dNTP 和小鼠 RNase 抑制剂。Taq 热启动 DNA 聚合酶与新型温启动反转录酶联合使用，可通过基于适配体的可逆抑制来双重控制酶的活性。这种温控活化机制可避免热循环前的非特异扩增，从而让室温建立体系更安全。经改造的 Luna 温启动反转录酶具有更高的热稳定性，最佳反应温度为 55°C。该剂型不含参比染料，适用于不需要 ROX 参比染料的仪器（如需 ROX 矫正，可添加 ROX）。

RT-qPCR 的高灵敏度使得避免 DNA 污染尤为重要。由于先前扩增产物可作为后续反应的底物，因此反应体系加入 dUTP 和热敏 UDG 可防止模板残留污染。热敏 UDG 超过 50°C时会完全失活，因此对 qPCR 性能没有影响。

图 1：使用 Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG（无 ROX）检测病毒 RNA

Luna® 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG（无 ROX） |

使用 Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG（无 ROX）对 SARS-CoV-2（N1 基因）、Zika（POLY 基因）、Dengue（E 基因）、Chikungunya（E2 糖蛋白基因）进行 RT-qPCR 检测。配制 20 ul 反应体系，对 5-log 浓度梯度样品（100，000–10 拷贝/反应）进行扩增性能评估，实验仪器为 Bio-Rad® CFX96 实时荧光定量仪。扩增模板为：新冠状病毒（SARS-CoV-2）合成 RNA Control 2（Twist Biosciences，SKU：102024）、寨卡病毒（ZIKV）合成 RNA（ATCC® VR-3252SD™）、2 型登革热病毒（Dengue）合成 RNA（ATCC VR-3229SD™），基孔肯雅病毒（Chikungunya）合成 RNA（ATCC VR-3246SD™），上述模板分别稀释于 10 ng Jurkat 总 RNA（BioChain，#R1255815-50）中。结果显示：所有病毒靶基因扩增的灵敏度和线性度都非常理想。

图 2：Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG，含或不含 ROX 剂型多重扩增性能一致

Luna® 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG（无 ROX） |

使用 Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG，含或不含 ROX 剂型（NEB# M3019 和 NEB # M3029）对 5 log 浓度范围（100 ng至10 pg）的 Jurkat 总 RNA 进行多重 RT-qPCR，实验仪器为 Bio-Rad® CFX96 实时荧光定量仪。分别使用两种 Luna 试剂对 5 个人源靶基因制作扩增标准曲线。配制 20 μl 反应体系，其中引物和探针浓度均为 200 nM，使用产品推荐的循环条件。如 B 图所示，两种 Luna 试剂的 ACTIN（使用 Texas Red 标记探针）标准曲线重叠，这说明在没有 ROX 参比染料的情况下，扩增性能良好。如 C 图所示：针对 5 个靶基因的多重线性检测，均展现出良好的扩增效率和 R2 值。

图 3：探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG，含或不含 ROX 剂型均可得到高质量结果

Luna® 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG（无 ROX） |

两位实验人员分别按照操作说明书，使用 Bio-Rad CFX96 实时荧光定量仪器，用两种荧光定量试剂盒分别对 8 个不同丰度、长度和 GC 含量的靶标（通过不同颜色显示）进行一步法 RT-qPCR 测试。反应结果就以下方面进行评估：扩增效率、低样品量检测能力及无模板扩增值（ΔCq=无模板对照的平均 Cq-最低起始量的平均 Cq）。此外，基于前面的度量值（质量得分）还评估了扩增结果的一致性、可重复性和总体曲线质量。结果显示：Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG（无 ROX）（NEB #M3029）和 Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG（NEB #M3019）落在绿框里的结果数量相同，即两者检测性能一致。

该预混液包含无荧光的可见蓝色可见示踪染料，有助于透明管加样。该示踪染料与 qPCR 常用荧光基团的光谱没有重叠，也不会干扰实时检测。

图 4：Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG（无 ROX）包含无干扰的可见蓝色示踪染料可避免加样错误

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产品类别:
Luna® qPCR & RT-qPCR Products,
PCR, qPCR & Amplification Technologies Products

应用:
cDNA Synthesis

  • 产品组分信息

    本产品提供以下试剂或组分：

    NEB # 名称 组分货号 储存温度 数量 浓度
    • M3029S     -20    
        Luna® Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG (No ROX) M3029SVIAL -20 2 x 0.5 ml 4 X
        Nuclease-free Water B1502AVIAL -20 2 x 1.5 ml Not Applicable
    • M3029L     -20    
        Luna® Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG (No ROX) M3029LVIAL -20 2 x 1.25 ml 4 X
        Nuclease-free Water B1502AVIAL -20 4 x 1.5 ml Not Applicable
    • M3029E     -20    
        Luna® Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG (No ROX) M3029EVIAL -20 1 x 10 ml 4 X
        Nuclease-free Water B1502EVIAL -20 1 x 25 ml Not Applicable

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操作说明、说明书 & 用法

  • 操作说明

    1. Protocol for Luna® Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG (No ROX) (NEB #M3029)

  • 应用实例

    • Optimized conditions for the CDC Influenza SARS-CoV-2 (Flu SC2) Multiplex Assay using Luna One-Step RT-qPCR Reagents

FAQs & 问题解决指南

  • FAQs

    1. How do I use qPCR to determine the concentration of my material?
    2. Can I set up my Luna® RT-qPCR at room temperature?
    3. Should I use probe- or dye-based detection for my qPCR assays?
    4. How should I design primers for Luna® qPCR?
    5. How long should my amplicon be for qPCR?
    6. Why is the Luna® qPCR Mix blue? Will this dye interfere with detection?
    7. Can I run the Luna® qPCR Mix on my qPCR instrument?
    8. Can I use fast instrument settings with the Luna® qPCR Mix?
    9. Do I need to add ROX?
    10. What RNA samples can be used in RT-qPCR with the Luna® Mix?
    11. How much primer and probe should I use with the Luna® Universal Probe RT-qPCR Kit?
    12. Can I use shorter cycling times?
    13. How much RNA template should I use in my RT-qPCR reaction?
    14. Can I run multiplex reactions with the Luna® Probe One-Step RT-qPCR Kits? Do I need to change my reaction conditions?
    15. Can I use a ROX-labeled probe with the Luna® Probe Mixes that contain a universal ROX reference dye?
    16. Can alternative probe based detection strategies be used with the Luna® Probe Mix?
    17. What temperature should I use for cDNA synthesis with Luna® RT-qPCR kits?
    18. Can I use longer targets in one-step RT-qPCR?
    19. Is the Monarch Total RNA Miniprep Kit compatible with Luna RT-qPCR Reagents?
    20. Are the Monarch RNA Cleanup Kits (NEB # T2030, #T2040, #T2050) compatible with Luna RT-qPCR reagents?
    21. What are the differences between the Luna One-Step RT-qPCR products (NEB #E3006, #E3007, #M3019, #M3029 and #L4001)?
    22. Other companies recommend a 2-min incubation at 25°C for carryover prevention, is a 30-sec incubation at 25°C sufficient?
    23. How can I perform a no-RT Control? 
    24. Can I use the Luna Probe RT-qPCR mixes for viral detection?

质控、安全 & 法规

  • 质控分析

    每一新批次的 NEB 产品都要经过质控，以满足指定的质量标准，对特定产品的质量标准和每一批次的检测数据可以通过产品说明表格、COA、产品信息卡或者产品手册进行查阅或下载。关于 NEB 产品质控的详细信息，可从此处查阅。

  • 产品说明与变更通知

    产品说明表包含产品的储存温度、有效期和规格，这些文件的命名规则如下：[货号]_[规格]_[版本]

    • M3029S_L_E_v2

  • CoA 文件包含单个批次产品的储存温度、有效期和质控，这些文件的命名规则如下： [货号]_[规格]_[版本]_[Lot#]

    • M3029E_v1_10122696
    • M3029L_v1_10120297
    • M3029S_v1_10120296
    • M3029L_v1_10137516
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    • M3029L_v2_10176923
    • M3029S_v2_10178550
    • M3029E_v2_10178547
    • M3029S_v2_10208044
    • M3029E_v2_10219884
    • M3029L_v2_10215744
    • M3029E_v2_10233815
    • M3029L_v2_10233298

  • SDS

    以下 SDS 文件可以帮助您安全地使用该产品

    • Luna® 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液，含 UDG（无 ROX）
    • Nuclease-free Water